NK細(xì)胞調(diào)節(jié)移植抗宿主病中同種反應(yīng)性T細(xì)胞應(yīng)答的作用及機(jī)制研究.pdf

1、在本研究中我們首先分析臨床造血干細(xì)胞移植后NK細(xì)胞及其受體的重建與aGVHD的關(guān)系;接著，我們通過(guò)動(dòng)物模型和體外細(xì)胞研究探討供者來(lái)源的NK細(xì)胞負(fù)向調(diào)節(jié)aGVHD中的同種反應(yīng)性T細(xì)胞應(yīng)答的作用及相關(guān)機(jī)制;最后我們探討達(dá)沙替尼和AMD3100兩個(gè)藥物對(duì)NK細(xì)胞的體外擴(kuò)增、移植物動(dòng)員和生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)作用。我們的研究有助于深入闡明NK細(xì)胞調(diào)節(jié)aGVHD中T細(xì)胞應(yīng)答的機(jī)制，完善aGVHD的發(fā)生機(jī)制，建立aGVHD預(yù)警的生物學(xué)標(biāo)志;同時(shí)對(duì)尋找aG

2、VHD有效預(yù)防和治療的新策略具有重大的理論和實(shí)際意義。
　　具體研究分為3部分:
　　1) Allo-HSCT后NK細(xì)胞及其受體的重建與aGVHD的關(guān)系;2）NK細(xì)胞抑制aGVHD中同種反應(yīng)性T細(xì)胞應(yīng)答的作用和機(jī)制;3）酪氨酸激酶抑制劑和干細(xì)胞動(dòng)員劑對(duì)NK細(xì)胞的aGVHD調(diào)節(jié)作用的影響。
　　第一章 Allo-HSCT后NK細(xì)胞及其受體的重建與aGVHD的關(guān)系
　　目的:通過(guò)檢測(cè)移植后Allo-HSCT后早期NK

3、細(xì)胞及其受體的動(dòng)態(tài)重建規(guī)律，分析與aGVHD的關(guān)系，為探討NK細(xì)胞在A(yíng)llo-HSCT中對(duì)aGVHD的調(diào)節(jié)作用提供線(xiàn)索，并為移植后進(jìn)一步明確患者aGVHD危險(xiǎn)分層和早期預(yù)警尋找合適的指標(biāo)。
　　方法:研究對(duì)象為2012年4月至2013年12月在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院骨髓移植中心接受異基因造血干細(xì)胞移植的患者，共63名患者及相應(yīng)的健康供者進(jìn)入臨床研究，在造血干細(xì)胞移植后3月內(nèi)每1-2周采血一次，使用流式細(xì)胞術(shù)檢查移植物和移植后外

4、周血中T和NK細(xì)胞的比例、NK細(xì)胞亞群分布、NK細(xì)胞表面NKG2D/DNAM-1/NKP46/NKG2A等受體表達(dá)以及T細(xì)胞表面CD25/CD69/MICA/MICB/PVR/Nectin2等表達(dá)，并結(jié)合臨床GVHD資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果:2012年5月-2013年12月，在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院骨髓移植中心，共有63例患者納入研究，其中ALL27例，AML26例，NHL2例，MDS7例，CML1例。中位年齡30歲(12

5、歲-50歲)，男性34例，女性29例。接受親緣全相合移植22例，無(wú)關(guān)供者移植14例，半相合移植27例。共36例患者發(fā)生aGVHD(57.14％)，27例無(wú)aGVHD發(fā)生(42.86％)，分別納入aGVHD組和無(wú)aGVHD組。在發(fā)生aGVHD組的患者，輸注的移植物中NK細(xì)胞的百分比為（8.95±6.38）％、NK細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)(19.87±14.72)*106/Kg、NK與T細(xì)胞的數(shù)量比值為0.14±0.09。而在未發(fā)生aGVHD組的患者，

6、輸注的移植物中NK細(xì)胞的百分比為（10.64±5.73）％、NK細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)(20.66±10.57)*106/Kg、NK與T細(xì)胞的數(shù)量比值為0.20±0.11。aGVHD組與無(wú)aGVHD組間比較，NK細(xì)胞百分比例和絕對(duì)計(jì)數(shù)差別無(wú)統(tǒng)計(jì)意義，而NK∶T比值在無(wú)aGVHD組高于aGVHD組，P＜0.05。在移植后較長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)，重建的NK細(xì)胞亞群分布與健康供者存在差異，在重建早期，CD56bright、NKG2A+和CD11b+CD27+這

7、些相對(duì)不成熟的亞群的比例顯著高于健康對(duì)照，隨著時(shí)間推移，逐步發(fā)育成熟。移植后最早重建的NK細(xì)胞的NKG2A陽(yáng)性率在aGVHD組為76.00±9.20％，高于無(wú)aGVHD組（59.59±6.10％）。移植后早期重建的NK細(xì)胞表達(dá)活化型受體NKP46與健康供者無(wú)顯著差異，而NKG2D和CD226的水平較健康供者降低，其中NKG2D及CD226的水平在aGVHD組低于無(wú)aGVHD組。CD226的配體PVR在aGVHD組T細(xì)胞表面的表達(dá)水平為2

8、470.39±1461.73，高于無(wú)aGVHD組（1440.81±648.44，P＜0.05）和健康供者（1148.91±281.64，P＜0.05）。T細(xì)胞表面表達(dá)Nectin2的水平在移植后aGVHD組與無(wú)aGVHD組無(wú)顯著差異。NKG2D的配體MICA/B在移植后aGVHD組T細(xì)胞表面表達(dá)水平為3827.00±1849.34，高于無(wú)aGVHD組（1760.18±1010.87，P＜0.05）和健康供者（1570.82±1235.1

9、5，P＜0.05）。在aGVHD患者，NK細(xì)胞對(duì)活化T細(xì)胞的脫顆粒和細(xì)胞毒作用顯著低于健康供者，采用IL-15激活能夠部分逆轉(zhuǎn)aGVHD患者NK細(xì)胞的表型和功能缺陷。
　　結(jié)論:NK細(xì)胞是造血干細(xì)胞移植后最早重建的淋巴細(xì)胞亞群，其數(shù)量和功能的重建影響aGVHD的進(jìn)程。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，移植物中NK∶T細(xì)胞的比例與aGVHD的發(fā)生率相關(guān)。移植后重建的NK細(xì)胞表面DNAM-1/NKG2D活化型受體表達(dá)水平下降，而NKG2A水平增高，

10、導(dǎo)致其殺傷活化T細(xì)胞和負(fù)向調(diào)節(jié)aGVHD的功能受損。NK細(xì)胞重建早期的DNAM-1/NKG2D表達(dá)水平與aGVHD的發(fā)生有關(guān)。Allo-HSCT后供者NK細(xì)胞亞群和受體的早期重建可能參與aGVHD的調(diào)節(jié)過(guò)程。
　　第二章 NK細(xì)胞抑制aGVHD中同種反應(yīng)性T細(xì)胞應(yīng)答的作用和機(jī)制
　　目的:本部分的目的是探討供者來(lái)源的NK細(xì)胞在動(dòng)物模型中對(duì)aGVHD中的同種反應(yīng)性T細(xì)胞應(yīng)答的調(diào)節(jié)作用，并通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡明相應(yīng)的分子機(jī)制。<

11、br>　　方法:建立小鼠MHC單倍體相合的aGVHD模型，在該模型基礎(chǔ)上比較不同NK∶T細(xì)胞輸注比例對(duì)小鼠aGVHD的調(diào)控作用，對(duì)供者T細(xì)胞增殖、凋亡以及T細(xì)胞亞群的影響;采用流式細(xì)胞儀分選供者PBMCs中的CD3+T細(xì)胞和CD56+NK細(xì)胞，采用PHA、Allo-DC、anti-CD3/CD28單抗刺激CFSE標(biāo)記的供者T淋巴細(xì)胞增殖，比較加入不同比例的供者NK細(xì)胞抑制各種刺激引起的T淋巴細(xì)胞增殖的能力，采用CFSE-7AAD雙標(biāo)殺傷

12、實(shí)驗(yàn)和基于CD107a釋放的脫顆粒實(shí)驗(yàn)檢測(cè)供者NK細(xì)胞對(duì)活化的供者T細(xì)胞的細(xì)胞毒功能，采用抗體阻斷試驗(yàn)檢測(cè)NK細(xì)胞殺傷活化T細(xì)胞過(guò)程中NKG2D、LFA-1、DNAM-1、FAS、NKG2A、TIM-3等受體的功能，采用Western blot檢測(cè)與活化的T細(xì)胞相互作用后NK細(xì)胞內(nèi)部ERK信號(hào)的磷酸化水平。
　　結(jié)果:1）在MHC單倍體相合的小鼠GVHD模型中，NK細(xì)胞能夠抑制T細(xì)胞增殖、促進(jìn)活化T細(xì)胞凋亡，具有GVHD保護(hù)作用;

13、2）在淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)供者NK細(xì)胞能夠抑制PHA、anti-CD3/CD28單抗以及異基因DC刺激引起的供者T細(xì)胞增殖，并且隨著NK∶T細(xì)胞比例的增加，抑制作用也增強(qiáng);3）在細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)中供者NK細(xì)胞能夠選擇性殺傷激活的供者T細(xì)胞，而對(duì)靜息狀態(tài)下的T細(xì)胞沒(méi)有殺傷作用，脫顆粒實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)NK細(xì)胞僅與激活T細(xì)胞共孵育才具有脫顆粒反應(yīng)，不同亞群的NK細(xì)胞對(duì)活化T細(xì)胞的脫顆粒反應(yīng)也不同，其中NKG2A+＞ NKG2A-，CD56dim＞

14、 CD56bright;4）與靜息狀態(tài)相比，激活的T細(xì)胞表達(dá)更高水平的MICA/B、ULBP-1/4、PVR、ICAM-1等激活型NK受體的配體;5)抗體阻斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示NKG2D、DNAM-1、LFA-1促進(jìn)NK細(xì)胞對(duì)活化T細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，NKG2A、TIM-3抑制NK細(xì)胞對(duì)活化T細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，F(xiàn)AS/FASL通路不參與這一過(guò)程;6)NK細(xì)胞與活化的自身T細(xì)胞接觸后10-30min，ERK蛋白即出現(xiàn)快速的磷酸化。
　　結(jié)論

15、:我們首先通過(guò)小鼠模型證實(shí)供者NK細(xì)胞能夠抑制T細(xì)胞增殖、促進(jìn)活化T細(xì)胞凋亡，具有GVHD保護(hù)作用。接著，我們首次在人體體外試驗(yàn)中證實(shí)同種抗原活化的供者T細(xì)胞通過(guò)上調(diào)NK細(xì)胞活化型受體的配體，激發(fā)供者NK細(xì)胞對(duì)自身活化T細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，ERK信號(hào)參與NK細(xì)胞對(duì)活化T細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。NK細(xì)胞通過(guò)LFA-1/NKG2D/CD226激活受體信號(hào)觸發(fā)的細(xì)胞毒作用來(lái)負(fù)向調(diào)節(jié)同種抗原刺激的T細(xì)胞增殖的能力。
　　第三章干細(xì)胞動(dòng)員劑和酪氨酸

16、激酶抑制劑對(duì)NK細(xì)胞的aGVHD調(diào)節(jié)作用的影響
　　目的:最近研究表明某些移植合并用藥可能會(huì)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能，本部分的目的是探討移植中應(yīng)用的干細(xì)胞動(dòng)員劑AMD3100和靶向藥物TKIs對(duì)NK細(xì)胞的移植物動(dòng)員效應(yīng)、生物學(xué)功能以及體外擴(kuò)增的調(diào)節(jié)作用，旨在探尋能夠充分激發(fā)Allo-HSCT中NK的GVL效應(yīng)并增強(qiáng)NK細(xì)胞的GVHD調(diào)節(jié)功能的最佳方案。
　　方法:采用CB6F1小鼠作為受試對(duì)象，按干細(xì)胞動(dòng)員方案分4組:(1)PBS對(duì)

17、照組;(2)AMD3100組:5mg/Kg，單劑量腹腔注射;(3)G-CSF組:250mg/kg/d*5d，腹腔注射;(4)G-CSF+AMD3100組:劑量同上。給藥后0h、1h、2h、4h尾靜脈采血，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)NK細(xì)胞的動(dòng)員效率;在給藥后立即通過(guò)尾靜脈按細(xì)胞數(shù)1∶1輸注0.5uM和10uMCFSE標(biāo)記的親代小鼠C57BL/6(CFSElow)和CB6F1（CFSEhigh）的脾細(xì)胞，第4天應(yīng)用FCM檢測(cè)CFSEl

18、ow和CFSEhigh細(xì)胞比例并計(jì)算NK細(xì)胞的體內(nèi)殺傷率;在給藥后4h獲取小鼠的脾細(xì)胞，通過(guò)流式分選NK1.1+NK細(xì)胞，體外檢測(cè)NK細(xì)胞對(duì)YAC-1細(xì)胞株的脫顆粒作用以及殺傷活性。
　　從健康成年人外周血中分離單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)，采用添加IL-2、IL-15的10％人AB血清的SCGM培養(yǎng)液進(jìn)行NK細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)，在此培養(yǎng)體系中添加不同濃度的伊馬替尼、尼洛替尼或者達(dá)沙替尼，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)和FCM檢測(cè)細(xì)胞表型比較三種TKIs對(duì)

19、NK細(xì)胞體外擴(kuò)增效率的影響;采用CFSE標(biāo)記增殖試驗(yàn)檢測(cè)達(dá)沙替尼對(duì)NK細(xì)胞抑制同種抗原刺激的T細(xì)胞增殖的影響;接著采用脫顆粒試驗(yàn)結(jié)合CFSE/7AAD細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)比較三種TKIs對(duì)NK細(xì)胞殺傷白血病細(xì)胞和激活T細(xì)胞功能的影響。
　　結(jié)果:5mg/kg的AMD3100單次注射能夠有效的動(dòng)員NK細(xì)胞，0h、1h、2h、4h外周血NK細(xì)胞絕對(duì)數(shù)分別是(4.89±0.83)*105/ml，(22.85±3.91)*105/ml，(34.77

20、±2.82)*105/ml，(23.19±1.82)*105/ml;2h的NK數(shù)達(dá)到峰值，4h之后回落。單獨(dú)采用G-CSF注射組則無(wú)NK細(xì)胞動(dòng)員作用，AMD3100+G-CSF組與AMD3100組具有類(lèi)似的NK細(xì)胞動(dòng)員規(guī)律，在各時(shí)間點(diǎn)兩組間的NK細(xì)胞絕對(duì)數(shù)無(wú)顯著差異。在NK細(xì)胞體內(nèi)殺傷實(shí)驗(yàn)中，G-CSF組對(duì)親代細(xì)胞的排斥率為62.14±2.34％，低于PBS對(duì)照組69.09±2.64％; AMD3100組對(duì)親代細(xì)胞的排斥率為80.67±

21、4.87％，高于PBS對(duì)照組(P＜0.05)，AMD3100+G-CSF組與AMD3100組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。在體外研究中，AMD3100組NK細(xì)胞的脫顆粒反應(yīng)以及殺傷效率與PBS對(duì)照組間無(wú)顯著差異，而G-CSF組以及G-CSF+AMD3100組NK細(xì)胞的體外細(xì)胞毒功能低于對(duì)照組。
　　三種TKIs中，只有達(dá)沙替尼能夠在體外增加NK細(xì)胞的體外擴(kuò)增效率，而伊馬替尼和尼洛替尼不能促進(jìn)NK細(xì)胞的擴(kuò)增。隨著培養(yǎng)體系中達(dá)沙替尼濃

22、度的增加，NK細(xì)胞的純度逐步升高，但是高濃度的達(dá)沙替尼還會(huì)引起NK細(xì)胞的凋亡，NK細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)在20nM達(dá)到峰值。采用20nM的達(dá)沙替尼作用后的NK細(xì)胞能夠更加有效地抑制同種抗原刺激后的自體T細(xì)胞增殖，并且達(dá)沙替尼能夠增加NK細(xì)胞對(duì)活化T細(xì)胞以及白血病細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。達(dá)沙替尼體外擴(kuò)增的NK細(xì)胞中細(xì)胞毒功能較弱的NKG2A+CD57-亞群比例下降，而細(xì)胞毒功能較強(qiáng)的NKG2A-CD57+亞群比例增高。達(dá)沙替尼能夠促進(jìn)NK細(xì)胞表面的CD2

23、26、NKP46及NKG2D等活化型受體表達(dá)的上調(diào)。
　　結(jié)論:AMD3100用于造血干細(xì)胞移植的動(dòng)員可以提高移植物中NK細(xì)胞的數(shù)量，增加移植物中NK∶T比例，并且不影響NK細(xì)胞的細(xì)胞毒功能。適當(dāng)濃度的達(dá)沙替尼可以增強(qiáng)NK細(xì)胞體外擴(kuò)增的效率，并能夠上調(diào)擴(kuò)增的NK細(xì)胞表面活化型受體的表達(dá)和優(yōu)先擴(kuò)增胞毒功能較強(qiáng)的NKG2ACD57+亞群，從而增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)活化T細(xì)胞和AML細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。我們的研究為目前Allo-HSCT中通過(guò)聯(lián)合