宿主抗衣原體感染中NKT細胞和NK細胞相互作用的研究.pdf

1、衣原體(Chlamydia)是一類革蘭氏染色陰性的專性細胞內(nèi)寄生菌，其中包括人們所熟知的人類致病菌沙眼衣原體(C.trachomatis、Ct)和肺炎衣原體(C.pneumoniae、Cpn)。衣原體通過感染結(jié)膜、呼吸道以及生殖道粘膜上皮細胞導(dǎo)致廣泛的人類疾病。沙眼衣原體是最常見的導(dǎo)致性傳播疾病的病原菌，并能引起多種長期后遺癥，如慢性盆腔炎，不孕癥，異位妊娠。而沙眼衣原體中的沙眼血清型還是引起可預(yù)防性感染性失明的主要原因。肺炎衣原體是一

2、系列人類急慢性呼吸道疾病的病因，如上呼吸道感染，肺炎以及慢性阻塞性肺疾病(COPD)。最新的研究還顯示了肺炎衣原體與動脈粥樣硬化性心血管疾病以及部分腦神經(jīng)失調(diào)的發(fā)展和高風險密切相關(guān)。流行病學研究表明衣原體感染仍然是嚴重的世界范圍內(nèi)的公共健康問題。雖然抗生素治療對衣原體感染有效，但是由于衣原體感染通常以無癥狀的隱形感染形式存在，使得被感染者不能及時的尋求診斷和治療，從而在一定程度上限制了抗生素治療對衣原體感染的控制力。因此，開發(fā)安全有效的

3、疫苗對于干預(yù)高流行性衣原體感染和預(yù)防長期后遺癥具有更加重要的意義。迄今為止，由于缺乏對衣原體感染免疫機制的深入了解，尚無預(yù)防衣原體感染的有效疫苗。
　　 對宿主抗感染機制的最新研究進展揭示了固有免疫和適應(yīng)性免疫的連接在控制和清除感染性疾病中的重要作用。NK細胞和NKT細胞是固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，其作用涉及多種類型的疾病，并在連接固有免疫和適應(yīng)性免疫中發(fā)揮橋梁作用。雖然它們分屬于不同的細胞譜系，但NK細胞和NKT細胞表現(xiàn)出驚

4、人的相似性，例如表達相同的NKR-P1和Ly49受體，具有無需前期致敏即發(fā)揮效應(yīng)功能的能力。它們在最初的抗感染斗爭中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并且通過與樹突狀細胞的相互作用對適應(yīng)性免疫的建立和發(fā)展作出重要貢獻。一些前期研究揭示了NK和NKT細胞應(yīng)答涉及多種類型的衣原體感染。NKT細胞在控制兩種不同的衣原體鼠型衣原體C.muridarum(Cm)和肺炎衣原體C.pneumoniae(Cpn)感染中發(fā)揮不同作用。NK細胞在Cm小鼠生殖道感染中起保護性作

5、用，但是對RAG-/-小鼠Cpn肺感染模型的研究顯示NK細胞在固有的抗感染機制中似乎不起作用。雖然這些研究顯示了NK細胞涉及宿主抗衣原體感染的現(xiàn)象，但是NK細胞發(fā)揮其功能的具體機制仍然不清楚。此外，在衣原體感染中，NK與NKT這兩種重要的固有免疫細胞之間的相互關(guān)系尚無報道。
　　 在本研究中，利用抗體封閉策略以及基因缺陷小鼠，我們著重探討了兩方面的問題：1)采用兩種不同的衣原體感染模型，研究衣原體感染中NKT細胞對NK細胞功能的

6、調(diào)節(jié)作用。2)NKT細胞對NK細胞功能的調(diào)節(jié)作用的機制。
　　 (一)NKT細胞對NK細胞兩種主要功能(IFN-γ的產(chǎn)生和殺傷功能)的調(diào)節(jié)作用，以及這種作用與NK細胞亞型
　　 自然殺傷T細胞(NKT細胞)是一類獨特的T淋巴細胞亞群。NKT細胞作為一種調(diào)節(jié)細胞能夠影響多種免疫細胞(如樹突狀細胞、巨噬細胞、B細胞、T細胞和NK細胞)功能的調(diào)節(jié)，同時作為一種效應(yīng)細胞能夠殺傷腫瘤細胞。一些研究利用α-GalCer對NKT細胞的

7、特異性激活作用揭示了NKT細胞對NK細胞的調(diào)節(jié)作用。但是這種調(diào)節(jié)是否在疾病狀態(tài)以及天然微生物感染中同樣發(fā)揮作用目前尚不清楚。本研究在Cm呼吸道感染模型中，利用NKT細胞缺陷小鼠和抗體封閉(anti-CDld mAb)策略，闡明了在衣原體感染中NKT細胞是否能夠影響NK細胞的免疫應(yīng)答，揭示了NKT細胞對NK細胞產(chǎn)生IFNγ以及對靶細胞殺傷的不同調(diào)節(jié)效應(yīng)。
　　 1.體外實驗中，鼠全脾細胞感染Cm后NK和NKT細胞的應(yīng)答情況將未感染

8、C57BL/6鼠全脾細胞在體外與活的Cm原體(EB)共培養(yǎng)，在感染后的不同時間點，我們通過采用流式細胞術(shù)檢測了細胞表面早期活化標志CD69的表達，從而評估NKT細胞(NK1.1+CD3e+)以及NK細胞(NK1.1+CD3e-)的活化情況。同時我們利用細胞內(nèi)細胞因子染色技術(shù)檢測了這兩種細胞IFNγ的產(chǎn)生水平。結(jié)果顯示：Cm體外感染迅速增加了CD69在NK及NKT細胞上的表達，誘導(dǎo)了NK和NKT細胞IFNγ的迅速產(chǎn)生。上述體外實驗結(jié)果說明

9、衣原體感染可以誘導(dǎo)NKT細胞和NK細胞的活化以及IFNγ產(chǎn)生。
　　 2.體外培養(yǎng)系統(tǒng)中，Cm活化的NKT細胞對NK細胞的影響。
　　 為了分析在衣原體感染中NKT細胞是否能夠影響NK細胞，我們在體外感染系統(tǒng)中比較了野生型小鼠和NKT基因敲除小鼠(Jα18-/-)脾臟NK細胞的應(yīng)答情況。通過在不同時間點檢測CD69和IFNγ的表達情況，我們發(fā)現(xiàn)：相對與野生型小鼠，NKT KO小鼠的NK細胞表現(xiàn)出顯著降低的CD69表達。由

10、于NKT細胞的活化主要依賴于CD1d-TCR的相互作用，因此我們在培養(yǎng)野生型小鼠脾細胞的加入CD1d封閉抗體，從而進一步確認NKT細胞活化對NK細胞的影響。用抗體封閉CD1d與TCR的相互作用從而阻斷NKT細胞的活化，顯著抑制了NK細胞CD69的表達和IFNγ的產(chǎn)生。利用NKT KO鼠以及CD1d抗體封閉實驗，我們證實了NKT細胞對NK細胞活化和細胞因子產(chǎn)生的重要調(diào)節(jié)作用。然而NK細胞CD69表達和IFNγ產(chǎn)生并非完全依賴于NKT細胞。

11、
　　 3.體內(nèi)Cm感染模型中，NKT和NK細胞的活化及擴增
　　 在體外感染系統(tǒng)中，我們已經(jīng)揭示了Cm感染后NKT和NK細胞的活化以及NKT細胞對NK細胞的影響。繼而，我們進一步在衣原體體內(nèi)感染模型中觀察了NKT和NK細胞對衣原體呼吸道感染的應(yīng)答情況。Cm肺感染后，兩種細胞在淋巴細胞中百分比均顯著增加，同時兩種細胞的絕對數(shù)也明顯增加。除此以外，我們還觀察到肺NKT細胞和NK細胞增加了CD69的表達。脾臟中有類似的現(xiàn)象。

12、結(jié)果說明Cm呼吸道感染可以誘導(dǎo)NKT和NK細胞的活化及數(shù)目的擴增，從而進一步驗證了體外實驗中所得到的結(jié)果。
　　 4.Cm呼吸道感染后NK細胞的功能改變
　　 在觀察到Cm肺感染中NK細胞的活化及數(shù)目的擴增后，我們進一步檢測了NK細胞活化后功能的變化，包括IFNγ的產(chǎn)生以及對靶細胞的殺傷效應(yīng)。結(jié)果顯示：肺NK細胞在感染后第一天就表現(xiàn)出迅速加強的IFNγ分泌。流式細胞術(shù)檢測NK細胞表面CD107a的表達情況，顯示Cm的感染

13、顯著加強了NK細胞的脫顆粒作用，即增強了殺傷功能。以上結(jié)果提示我們在Cm肺感染過程中，NK細胞不僅快速產(chǎn)生了IFNγ，而且顯示出增強的殺傷功能。
　　 5.NKT細胞缺陷對NK細胞功能的調(diào)節(jié)
　　 為了進一步研究衣原體感染后NKT細胞對NK細胞的調(diào)節(jié)作用，我們首先比較了野生型小鼠和NKT KO鼠在衣原體感染后脾臟和肺部NK細胞數(shù)目的改變：NKT KO鼠在Cm感染后，脾和肺NK(CD3-NK1.1+)的百分比和絕對數(shù)均顯著

14、低于野生型小鼠。其次，我們比較了感染后兩種小鼠NK細胞IFNγ的產(chǎn)生和脫顆粒作用從而進一步檢測NKT細胞對NK細胞功能的影響。感染后3天，NKT缺陷小鼠的肺和脾臟中產(chǎn)IFNγ的NK細胞的百分比明顯低于野生型小鼠。相反，NKT缺陷小鼠的肺和脾臟NK細胞在YAC-1的刺激下脫顆粒的水平(即CD107a的表達)反而明顯高于野生型小鼠。以上結(jié)果提示，NKT細胞對NK細胞的擴增有正向的積極的影響，但是，NKT細胞對NK細胞功能的影響則顯示出相反的

15、作用，即，在Cm感染過程中NKT細胞促進了NK細胞IFNγ的產(chǎn)生但卻抑制了NK細胞的殺傷功能。
　　 6.NKT細胞對NK細胞功能的調(diào)節(jié)作用與NK亞型的關(guān)系。
　　 在前面的實驗中，我們已發(fā)現(xiàn)NKT細胞對NK細胞產(chǎn)生IFNγ和殺傷功能的調(diào)節(jié)是不同的。如前所述，NK的不同亞群在其功能上各有偏重。而NKT細胞對NK兩種功能(IFNγ和殺傷)的調(diào)節(jié)差異，可能和NKT細胞針對NK細胞各個亞群調(diào)節(jié)作用的差異有關(guān)?；贜K1.1+C

16、D3e-NK細胞上CD11b和CD27的表達，我們分別檢測了Cm感染后野生型小鼠和NKT KO鼠NK細胞亞群的比例：相對野生型小鼠，感染后NKT KO鼠中NK細胞各個亞群的百分比發(fā)生明顯變化。結(jié)果說明，NKT細胞對NK細胞的成熟有一定影響，表現(xiàn)在NK亞型比例的改變，但是這種影響在感染的組織(肺)中是很微小的。
　　 進一步我們探討了NK細胞亞型的功能，包括檢測脾臟和肺中不同NK亞型的IFNγ產(chǎn)生和殺傷功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Cm感染過程

17、中脾臟和肺的各個NK細胞亞群在產(chǎn)生IFNγ以及殺傷過程中表達CD107a的能力有所不同，CD27highCD11bhighNK細胞在所有的NK細胞亞群中產(chǎn)生IFNγ的能力最高，并在殺傷過程中表達最高水平的CD107a。比較野生型小鼠和NKT KO小鼠中NK細胞亞群的功能差異，我們發(fā)現(xiàn)，NKT細胞對NK細胞不同功能的不同調(diào)節(jié)作用在不成熟的CD27highCD11blow和終末成熟的CD27lowCD11bhigh曲NK細胞亞群有所體現(xiàn)，在

18、較成熟CD27highCD11bhigh曲NK細胞亞群中表現(xiàn)的更加顯著。
　　 (二)樹突狀細胞(dendritic cell，DC)參與了NKT細胞對NK細胞功能的調(diào)節(jié)
　　 前期的研究報道了NKT細胞在Cm和Cpn感染中的不同作用并導(dǎo)致了不同的疾病結(jié)果。因此，我們進一步研究了NKT細胞對NK細胞功能的調(diào)節(jié)作用在Cpn感染中是否有所差異。
　　 1.C.pneumoniae感染誘導(dǎo)NK細胞的迅速擴增
　　

19、 首先，我們檢測了C.pneumoniae肺感染后NK細胞應(yīng)答的動力學模式。收集感染前和感染后不同時間點的肺單個核細胞以及脾細胞，通過免疫熒光染色和流式細胞術(shù)分析NK細胞的數(shù)量變化，結(jié)果顯示NK1.1+CD3e-細胞的百分比和絕對數(shù)在感染后第一天開始上升，在感染后第3天達到峰值。隨后NK細胞逐漸減少大約在第9天回到基礎(chǔ)水平。
　　 2.C.pneumoniae感染后NK細胞迅速活化并產(chǎn)生IFNγ
　　 為了確定感染后N

20、K細胞是否改變了活化狀態(tài)，我們檢測了肺臟和脾臟NK細胞表面兩種早期活化標志CD69和CD25的表達變化。我們發(fā)現(xiàn)：C.pneumoniae感染后24小時NK細胞即快速上調(diào)了CD69的表達。同時，細胞內(nèi)細胞因子染色顯示，NK細胞活化后產(chǎn)生大量IFNγ。結(jié)果表明，肺炎衣原體呼吸道感染進程中，無論是在免疫器官還是感染部位NK細胞均發(fā)生迅速的活化并產(chǎn)生大量的IFNγ。
　　 3.NKT細胞缺陷對NK細胞的擴增沒有影響，但降低了NK細胞的

21、活化水平
　　 為了檢測在C.pneumoniae感染中NKT細胞是否能夠影響NK細胞的活化。首先，我們比較了感染前后野生型小鼠和NKT缺陷小鼠NK細胞數(shù)目的變化。我們發(fā)現(xiàn)NKT細胞的缺失并沒有影響NK細胞的擴增。其次，我們比較了兩種小鼠NK細胞活化狀態(tài)的不同。通過檢測感染后NK細胞表面活化標志CD69和CD25的變化，我們發(fā)現(xiàn)：感染后第一天起，NKT缺陷小鼠相較與野生型小鼠NK細胞表達CD69的顯著降低。同時，NKT細胞缺陷小

22、鼠肺部NK細胞表達CD25也低于野生型小鼠。NKT細胞缺陷對脾臟NK細胞的活化狀態(tài)的影響與肺部相似。結(jié)果說明，C.pneumoniae感染后NKT細胞能夠促進NK細胞的活化。
　　 4.NKT細胞缺陷導(dǎo)致了NK細胞產(chǎn)生IFNγ的減少
　　 NKT細胞缺陷導(dǎo)致的NK細胞活化水平的降低不僅表現(xiàn)在NK細胞表型的變化上，NK細胞產(chǎn)IFNγ的功能也受到了影響。感染后，NKT缺陷小鼠來源的肺NK細胞IFNγ的染色陽性率顯著低于野生型

23、小鼠。同樣，脾臟NK細胞產(chǎn)生IFNγ的水平在NKT缺陷小鼠也有明顯的降低。C.pneumoniae肺感染的過程中，NKT細胞促進了感染早期NK細胞產(chǎn)生IFNγ。
　　 5.NKT細胞缺陷影響了NK細胞不同亞型的相對分布比例，但NK細胞產(chǎn)生IFNγ的降低并不局限于特定的NK細胞亞型
　　 前面的實驗中，我們已經(jīng)證實了NKT細胞對NK細胞活化程度和IFNγ產(chǎn)生的促進作用，接下來，我們檢測了NK細胞功能的改變是否與NK細胞亞型

24、的變化有關(guān)。脾臟NK細胞4個亞型的相對百分比在感染前的NKT缺陷小鼠和野生型小鼠間沒有區(qū)別。而C.pneumoniae感染后，與野生型小鼠相比，NKT缺陷小鼠中CD11blowWCD27highNK細胞明顯增加，而CD11bhighCD27lowNK細胞明顯減少，表明NKT細胞影響了感染后NK細胞的成熟。另外，對NK細胞亞型產(chǎn)IFNγ的檢測發(fā)現(xiàn)，NKT細胞缺陷顯著降低了NK細胞各個亞型IFNγ的陽性率，說明NKT細胞對NK細胞產(chǎn)IFNγ

25、功能的影響是統(tǒng)一的，并不局限于某一特定的亞型。
　　 6.NKT細胞缺陷小鼠來源的DC降低了誘導(dǎo)NK細胞活化的能力
　　 樹突狀細胞作為免疫系統(tǒng)的哨兵在啟動免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。DC通過細胞間的接觸和可溶性細胞因子誘導(dǎo)NK細胞活化。我們推測NKT缺陷小鼠中NK細胞功能的改變可能是由于DC功能的變化引起的。為驗證這一假設(shè)，我們進行了DC與NK細胞共培養(yǎng)的體外試驗，研究結(jié)果顯示，與Cpn感染W(wǎng)T小鼠的DC相比，未活化NK

26、細胞與Cpn感染NKT缺陷小鼠的DC共培養(yǎng)時NK細胞產(chǎn)生IFNγ的能力下降。結(jié)果說明，DC可能參與了NKT細胞對NK細胞產(chǎn)IFNγ功能的調(diào)節(jié)過程。
　　 7.NK細胞在宿主抗Cpn呼吸道感染中的作用
　　 研究顯示，RAG-1缺陷小鼠中，NK細胞對于宿主抵抗C.pneumoniae感染不是必須的。然而最新的一項研究顯示，在C.muridarum肺感染中，NK細胞通過對Th1應(yīng)答的增強作用加強了機體對衣原體感染的抵抗性。在

27、免疫功能完整的野生型小鼠中，NK細胞在宿主抗Cpn呼吸道感染中的作用尚不清楚。因此，我們檢測了野生型小鼠的NK細胞在抵抗C.pneumoniae感染中的作用。我們在感染前及感染過程中用anti-Asiola GM1抗體去除NK細胞，研究發(fā)現(xiàn)NK細胞的消除加重了Cpn肺感染，與WT鼠相比，NK細胞消除小鼠表現(xiàn)出更嚴重的體重損失和肺部細菌負荷。以上結(jié)果表明，NK細胞在宿主抗Cpn呼吸道感染中起保護性作用。
　　 綜上所述，本研究得出

28、以下結(jié)論：首先，在Cm呼吸道感染模型中，衣原體感染后NKT和NK細胞迅速活化(CD69表達上調(diào))并產(chǎn)生IFNγ，在衣原體感染中NKT細胞能夠影響NK細胞的免疫應(yīng)答，NKT細胞對NK細胞產(chǎn)生IFNγ以及對靶細胞殺傷功能具有不同的調(diào)節(jié)效應(yīng)，在這種感染模型中NKT細胞優(yōu)先的促進了NK細胞IFNγ的產(chǎn)生但是卻抑制了其殺傷功能。進一步地，這種對NK細胞不同功能的不同調(diào)節(jié)作用在不成熟的CD27highCD11blow和終末成熟的CD27lowCD1

29、1bhighNK細胞亞群有所體現(xiàn)，但在較成熟CD27highCD11bhighNK細胞亞群中表現(xiàn)的更加顯著。另外，在Cpn呼吸道感染模型中NKT細胞同樣表現(xiàn)出對NK細胞的調(diào)節(jié)作用，促進了NK細胞IFNγ的產(chǎn)生。這種調(diào)節(jié)功能并不局限于某種特定的NK細胞亞型。通過DC與NK細胞共培養(yǎng)的體外試驗，我們進一步闡明感染后NKT缺陷小鼠中DC功能的變化可能是導(dǎo)致NK細胞減少IFNγ的產(chǎn)生的原因之一，樹突狀細胞參與了NKT細胞對NK細胞功能的調(diào)節(jié)。<