版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進行舉報或認領(lǐng)
文檔簡介
1、副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis)作為豬上呼吸道的一種常在菌,在特定條件下可以侵入機體引起全身性疾病。近年來,該病給全球養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失,同時也引起了研究者的關(guān)注。目前,雖然有大量針對副豬嗜血桿菌的研究報道,尋找出許多毒力候選基因,但我們對副豬嗜血桿菌致病機制的了解還十分有限。
革蘭氏陰性細菌Ⅴ型蛋白分泌系統(tǒng),也稱為自轉(zhuǎn)運蛋白。該蛋白主要由3部分組成,包括信號肽,N端的passenger結(jié)構(gòu)域(
2、passenger domain)和C端的β結(jié)構(gòu)域(βdomain),其中passenger結(jié)構(gòu)域是其發(fā)揮功能的部分。研究表明,該蛋白與細菌的粘附、入侵、細胞毒性有關(guān),可介導(dǎo)生物被膜的形成和血清抗性的產(chǎn)生,因此被認為是病原微生物的一種重要的毒力因子。
為探究自轉(zhuǎn)運蛋白在副豬嗜血桿菌的致病過程中可能起到的作用,本論文將副豬嗜血桿菌SH0165菌株中發(fā)現(xiàn)的兩個自轉(zhuǎn)運蛋白基因at2和at3作為研究對象,運用PCR、原核表達、單克
3、隆抗體、蛋白免疫印跡等技術(shù)開展研究。主要研究結(jié)果如下:
1.a(chǎn)t2、 at3、 at2-passenger domain(at2-pd和at3-passenger domain(at3-pd)的克及相應(yīng)蛋白的原核表達
以SH0165菌株的基因組DNA為模板,PCR擴增at2、at3、at2-pd和at3-pd,四個片段大小分別為2336bp、2443bp、1368bp和1392bp,分別編碼771、780、4
4、50和458個氨基酸。將at2、at3分別與pET-30a連接,at2-pd、at3-pd分別與pET-28a連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli/DH5α菌株,將測序正確的質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化E.coli/BL21(DE3)菌株并進行原核表達。結(jié)果成功克隆了上述4個片段并構(gòu)建了其相應(yīng)的原核表達載體,在E.coli/BL21(DE3)菌株中實現(xiàn)了上述4種蛋白的原核表達,分別命名為AT2、AT3、AT2-PD和AT3-PD。
2.AT2-P
5、D和AT3-PD蛋白的純化及其單克隆抗體的制備
在E.coli/BL21(DE3)菌株中表達的AT2-PD和AT3-PD蛋白以可溶性的形式存在,利用蛋白融合表達的組氨酸標(biāo)簽對蛋白進行純化。使用純化的蛋白免疫BALB/c鼠進行單克隆抗體的制備工作。結(jié)果AT2-PD蛋白獲得5株能產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細胞株,分別命名為1E4、3C9、3D8、3E8和4B10; AT3-PD蛋白獲得5株能產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細胞株,分別命名為
6、2E6、3H8、4C8、4F12和4H10。間接ELISA和Western-blot分析表明抗體特異性良好,其中4B10的效價為1:102400;4H10的效價為1:25600,這兩份單克隆抗體用于后續(xù)實驗的開展。
3.AT2和AT3蛋白在E.coli/BL21(DE3)和SH0165上的定位分析
利用獲得的單克隆抗體結(jié)合Western-blot實驗分析AT2和AT3蛋白分別在E.coli/BL21(DE3)
7、-AT和SH0165上的定位情況。分別提取這兩種細菌的細胞總蛋白,細胞膜總蛋白和分泌蛋白。結(jié)果顯示,AT2和AT3蛋白分別存在于表達該蛋白的E.coli/BL21(DE3)菌株的細胞總蛋白,細胞膜總蛋白和分泌蛋白中;AT2蛋白存在于SH0165的細胞總蛋白和細胞膜總蛋白中;AT3蛋白存在于SH0165的細胞總蛋白、細胞膜總蛋白和分泌蛋白中。
4.AT2和AT3蛋白的免疫原性分析
由于AT2和AT3蛋白在SH0
8、165是細胞膜蛋白和/或分泌蛋白,故對其免疫原性進行分析。首先檢測其在15株HPS標(biāo)準血清型菌株中的分布情況,實驗表明at2基因除在標(biāo)準血清型4型菌株中未擴增出相應(yīng)條帶外,其余均可擴增出相應(yīng)條帶;at3基因在所有標(biāo)準血清型菌株中均可擴增出相應(yīng)條帶。利用純化的AT2-PD和AT3-PD蛋白作為抗原包被酶標(biāo)板,使用7份不同血清型菌株攻毒豬后獲得的感染血清進行間接ELISA實驗,結(jié)果顯示為陽性;同時利用Western-blot對該7份血清中針
9、對AT2-PD和AT3-PD的抗體也進行了檢測,結(jié)果也顯示為陽性。
5.AT2和AT3蛋白分別與細胞相互作用
使用分別表達AT2和AT3蛋白的E.coli/BL21(DE3)菌株分別與豬髖動脈內(nèi)皮細胞、豬肺細胞、豬氣管上皮原代細胞進行粘附與粘附阻遏實驗,結(jié)果顯示這兩種細菌與上述3種細胞均無明顯的粘附作用。分別使用純化的AT2-PD和AT3-PD蛋白與上述3種細胞進行結(jié)合實驗,通過間接免疫熒光觀察,表明這兩種蛋
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- II型草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白的免疫原性及其相互作用宿主蛋白的初步研究.pdf
- 30106.tfv與斑馬魚細胞模型的相互作用及isknv免疫原性蛋白的研究
- 副溶血弧菌免疫原性蛋白的鑒定及其研究.pdf
- 黃粉蟲纖溶活性蛋白免疫原性與抗血栓作用的研究.pdf
- 草魚呼腸孤病毒(GCRV096)VP6和NS38蛋白的免疫原性及其相互作用蛋白的篩選.pdf
- 人胚胎心肌祖細胞的免疫原性.pdf
- 小鼠神經(jīng)干細胞免疫原性的研究.pdf
- 惡性瘧原蟲重組蛋白HGXPRT免疫原性及免疫保護作用的研究.pdf
- 脂肪來源干細胞免疫原性和免疫調(diào)節(jié)作用的實驗研究.pdf
- 惡性瘧融合蛋白的表達及免疫原性研究.pdf
- 豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的表達及其免疫原性研究.pdf
- 布魯氏菌新型疫苗的構(gòu)建及其免疫原性研究.pdf
- 牙髓干細胞低免疫原性的體內(nèi)初步研究.pdf
- 牛支原體免疫原性研究.pdf
- 草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白的免疫原性研究.pdf
- 龍須菜多糖偶聯(lián)蛋白的制備與免疫原性研究.pdf
- 大豆蛋白抗原對斷奶仔豬的免疫原性及作用機理研究.pdf
- 胸膜肺炎放線桿菌保守表面蛋白的鑒定與免疫原性研究.pdf
- 絲狀支原體山羊亞種膜蛋白的組成與免疫原性研究.pdf
- 乙型肝炎病毒包膜M蛋白的表達與免疫原性研究.pdf
評論
0/150
提交評論