脂肪來源干細(xì)胞免疫原性和免疫調(diào)節(jié)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、近年來組織工程開始應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究，到目前已經(jīng)能夠成功地將體外大量擴(kuò)增的細(xì)胞與生物材料復(fù)合后植入體內(nèi)以達(dá)到恢復(fù)、替代、維持或提高組織器官功能的目的。種子細(xì)胞的大量獲取是組織工程所要解決的基本問題之一。理想的種子細(xì)胞應(yīng)該具有取材方便、來源廣泛、對(duì)機(jī)體損傷小、在體外培養(yǎng)體系中的增值傳代能力強(qiáng)、生物活性好、衰亡率低、能夠在短時(shí)間內(nèi)得到數(shù)量較多并易定向分化的細(xì)胞、免疫活性低、無致瘤性等特性。 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）是間充質(zhì)干

2、細(xì)胞（MSCs）中最早被發(fā)現(xiàn)的具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，并長(zhǎng)期應(yīng)用于干細(xì)胞和組織工程學(xué)研究領(lǐng)域。脂肪來源干細(xì)胞（ADSCs）自Zuk.等報(bào)道以來，大量的研究證實(shí)了其與骨髓MSCs相似的多向分化潛能，而由于來源廣泛、取材方便等優(yōu)點(diǎn)逐漸成為研究熱點(diǎn)。 研究表明，BMSCs在體外表現(xiàn)低免疫原性，并可發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的作用。最近的研究初步顯示，ADSCs擁有和BMSCs相似的表面標(biāo)志，僅表達(dá)中等水平MHC-Ⅰ類分子，不表達(dá)MHC-Ⅱ類分

3、子和B7-1、B7-2、CD40、CD40L等協(xié)同共刺激分子，導(dǎo)致T細(xì)胞的無反應(yīng)性而促成免疫耐受。即便在γ-干擾素的作用下，ADSCs在體外仍不能明顯刺激淋巴細(xì)胞的增殖。另一方面，在ADSCs和淋巴細(xì)胞的混合培養(yǎng)液中檢測(cè)到了高過正常濃度的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）和白介素10（IL-10）等有免疫抑制作用的細(xì)胞因子，提示ADSCs在體外受淋巴細(xì)胞刺激后可能通過分泌以上細(xì)胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。研究報(bào)道ADSC

4、s與B淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)后能明顯影響后者的抗體分泌。 本實(shí)驗(yàn)以家兔作為動(dòng)物模型，對(duì)家兔ADSCs的體外免疫原性及體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)作用開展初步探討，試為擴(kuò)充組織工程種子細(xì)胞的來源及拓展ADSCs的應(yīng)用領(lǐng)域提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 目的: 1.通過體外分離、培養(yǎng)及擴(kuò)增家兔ADSCs來觀察ADSCs的形態(tài)及相關(guān)生物學(xué)特性。 2.通過淋巴細(xì)胞刺激增殖實(shí)驗(yàn)和免疫原性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)來研究家兔ADSCs在體外的免疫原性。 3.通過

5、在同種異體移植皮片下局部注射ADSCs，探討ADSCs在體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)作用。 方法: 1.家兔ADSCs的分離培養(yǎng)及擴(kuò)增。 切取家兔皮下脂肪，使用酶消化法進(jìn)行分離和原代培養(yǎng)，觀察細(xì)胞形態(tài)及功能變化，臺(tái)盼藍(lán)拒染法測(cè)細(xì)胞活性，細(xì)胞傳至第3代后供實(shí)驗(yàn)用。 2.家兔ADSCs體外免疫原性的檢測(cè)。 在淋巴細(xì)胞刺激增殖實(shí)驗(yàn)中，將家兔淋巴細(xì)胞與PHA混合培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板48h后加入CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4小

6、時(shí)后用酶標(biāo)儀檢測(cè)其OD值；在ADSCs體外免疫原性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，將家兔淋巴分別與等量的自體ADSCs和同種異體ADSCs混合培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板48h后加入CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后用酶標(biāo)儀檢測(cè)以上各實(shí)驗(yàn)組的OD值。 3.家兔ADSCs在體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)作用的研究。 家兔共10只，隨機(jī)分為5組，每組2只互為同種異體皮片移植對(duì)象，在每只家兔的兩側(cè)臀部設(shè)計(jì)直徑為3cm的圓形皮片，切取后組內(nèi)、同側(cè)之間交互移植。實(shí)驗(yàn)組皮片移植的同

7、時(shí)在皮片下注射含自體ADSCs（1×106/kg）的完全培養(yǎng)基2ml；對(duì)照組皮片移植的同時(shí)在皮片下注射不含自體ADSCs的完全培養(yǎng)基2ml。觀察移植皮片的存活情況和壞死時(shí)間，并于術(shù)后第7天取材予切片并HE染色，進(jìn)行組織學(xué)觀察。 結(jié)果: 1.家兔ADSCs的分離培養(yǎng)及擴(kuò)增。 經(jīng)膠原酶消化后的原代ADSCs培養(yǎng)48h，第1次換液除去未貼壁細(xì)胞，大部分貼壁細(xì)胞呈寬大扁平的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞。ADSCs培養(yǎng)至6～8天后可形

8、成較致密的細(xì)胞層，覆蓋80%～90%的培養(yǎng)瓶，經(jīng)胰酶消化后按1：3傳代，細(xì)胞生長(zhǎng)速度較原代細(xì)胞明顯增快，3天后ADSCs即可覆蓋約80%的培養(yǎng)瓶。在培養(yǎng)細(xì)胞的第2、4、6、8和10天，臺(tái)盼藍(lán)拒染法測(cè)定細(xì)胞活性均在90%以上。 2.家兔ADSCs體外免疫原性的檢測(cè)。 家兔淋巴細(xì)胞的刺激增殖實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)板上各實(shí)驗(yàn)孔在加入CCK-8試劑4h后用酶標(biāo)檢測(cè)儀測(cè)得的OD值：實(shí)驗(yàn)組OD值為1.788±0.221；對(duì)照組OD值為0.52

9、4±0.070，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的OD值存在顯著性差異（配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，t=18.389，p=0.000<0.05）。 家兔ADSCs體外免疫原性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)板上各實(shí)驗(yàn)孔在加入CCK-8試劑4h后用酶標(biāo)檢測(cè)儀測(cè)得的OD值：實(shí)驗(yàn)組OD值為1.616±0.153；對(duì)照組OD值為1.505±0.170。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組OD值的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（兩樣本t檢驗(yàn)，t=1.195，p=0.260>0.05）。 3.家兔ADSCs在體內(nèi)

10、免疫調(diào)節(jié)作用的研究。 實(shí)驗(yàn)組移植皮片的壞死時(shí)間為7.170±1.472天，對(duì)照組移植皮片的壞死時(shí)間為5.830±1.169天；術(shù)后第7天的組織學(xué)觀察可見：實(shí)驗(yàn)組皮下浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞較少，皮下組織結(jié)構(gòu)清晰；對(duì)照組皮下浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞較多。 結(jié)論： 1.家兔同種異體ADSCs與等量自體ADSCs與淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)48h后用酶標(biāo)檢測(cè)儀測(cè)得的OD值無顯著性差異，提示ADSCs在體外并不能引起異體淋巴細(xì)胞的顯著增殖，證實(shí)了AD