脂肪基質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的體外研究及免疫調(diào)節(jié)作用的機制探討.pdf

1、第一部分、脂肪基質(zhì)干細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的比較
　　 目的：分離培養(yǎng)人脂肪基質(zhì)干細(xì)胞，并鑒定其表型，建立脂肪基質(zhì)干細(xì)胞的分離、純化、擴增和鑒定的方法。比較脂肪基質(zhì)干細(xì)胞(ASC)與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)生物學(xué)特性上的異同，為ASC的細(xì)胞移植治療提供實驗依據(jù)。
　　 方法：分離人脂肪組織，膠原酶Ⅰ消化后制備細(xì)胞懸液并培養(yǎng)，消化傳代以純化細(xì)胞。細(xì)胞計數(shù)法繪制脂肪基質(zhì)干細(xì)胞的生長曲線，流式細(xì)胞術(shù)及免疫熒光法檢測

2、其表型。密度梯度離心法分離骨髓單個核細(xì)胞，有核細(xì)胞貼壁法培養(yǎng)獲得MSC。對培養(yǎng)前后的ASC和MSC分別進行計數(shù)比較，流式細(xì)胞儀測定比較ASC和MSC 表面抗原表達(dá)的異同。通過混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗比較這兩種細(xì)胞免疫學(xué)特性的差別。
　　 結(jié)果：從脂肪中分離的細(xì)胞第3天開始貼壁生長，其倍增時間約為48小時。以后細(xì)胞主要呈梭形生長。其表型為CD31-CD34-CD45-HLA-DR-CD29+CD105+CD13+CD44

3、+。從骨髓中分離出的有核細(xì)胞數(shù)多于從脂肪中分離的有核細(xì)胞(P＜0.001)，但培養(yǎng)后獲得的干細(xì)胞數(shù)差別無顯著性意義(P＞0.05)。ASC和MSC 都表達(dá)CD13、CD29、CD44、CD105，而在CD49d、CD106的表達(dá)上存在差異。相同數(shù)量的ASC和MSC在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗中對淋巴細(xì)胞的抑制作用相當(dāng)(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：成功建立了從人脂肪組織中分離培養(yǎng)和擴增基質(zhì)干細(xì)胞的體系。ASC和MSC在細(xì)

4、胞表面抗原表達(dá)和免疫原性等方面既有相似之處，又存在一些差異，說明ASC是一群不同于MSC的細(xì)胞。
　　 第二部分、脂肪基質(zhì)干細(xì)胞多向分化潛能的研究
　　 目的：研究脂肪基質(zhì)干細(xì)胞(ASC)體外定向分化為心肌樣細(xì)胞、神經(jīng)元樣細(xì)胞、成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的能力，進一步了解ASC的生物學(xué)特性。
　　 方法：獲取并培養(yǎng)正常人的ASC。5-氮胞苷(5-Aza)誘導(dǎo)分化為心肌樣細(xì)胞，全反式維甲酸(ATRA)誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞

5、，不同濃度地塞米松聯(lián)合維生素C、β-磷酸甘油分別誘導(dǎo)ASC分化為成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。倒置顯微鏡觀察誘導(dǎo)后細(xì)胞的形態(tài)，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測心肌相關(guān)基因ANP、cTnT、cTnI和α MHC 及神經(jīng)細(xì)胞相關(guān)基因nestin的表達(dá)。免疫熒光法檢測cTnT和結(jié)蛋白的表達(dá)；Western blot 法檢測connexin43的表達(dá)。
　　 免疫組織化學(xué)染色法和Western blot 法檢測神經(jīng)絲蛋白(NF)和神經(jīng)元

6、烯醇化酶(NSE)的表達(dá)。Von Kossa 染色法檢測鈣鹽沉積，油紅O 染色法檢測誘導(dǎo)后脂肪細(xì)胞形態(tài)。
　　 結(jié)果：ASC 經(jīng)5-氮胞苷的作用可呈現(xiàn)典型的心肌樣細(xì)胞形態(tài)，ANP、cTnT、cTnI和α MHC基因及cTnT、結(jié)蛋白和connexin43 均呈陽性表達(dá)。不同擴增代數(shù)的ASC 經(jīng)誘導(dǎo)劑ATRA的作用均呈現(xiàn)典型的神經(jīng)元樣細(xì)胞形態(tài)，巢蛋白基因及NF、NSE 均表達(dá)陽性。ASC 向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)后有鈣鹽沉積，von Kos

7、sa 染色陽性；向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化后油紅O 染色陽性。
　　 結(jié)論：ASC 具有體外大量擴增并保持低分化狀態(tài)的特性，以及定向分化為心肌樣細(xì)胞、神經(jīng)元樣細(xì)胞、成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的能力,是一種可用于組織工程的理想的種子細(xì)胞。
　　 第三部分、脂肪基質(zhì)干細(xì)胞對異基因T 淋巴細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的影響及機制探討
　　 目的：研究ASC 對異基因T 淋巴細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞表型及分泌細(xì)胞因子的影響，探討ASC 發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的方

8、式和可能機制。
　　 方法：(1)將ASC 上清和ASC分別與異基因T 淋巴細(xì)胞進行混合培養(yǎng)。MTT 法檢測T 細(xì)胞的增殖，Annexin Ⅴ法檢測凋亡，流式細(xì)胞術(shù)檢測T 淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+細(xì)胞的比例，ELISA 法檢測T 細(xì)胞分泌IL-10和TGF-β1的水平，RT-PCR 法檢測FOXP3基因的表達(dá)。
　　 (2)將ASC 上清和ASC分別與異基因樹突狀細(xì)胞(DC)進行混合培養(yǎng)。流式細(xì)胞術(shù)檢測CD80、CD

9、83和CD86的表達(dá)，ELISA 法檢測DC表達(dá)IL-12的水平，RT-PCR 法檢測吲哚胺2，3 雙加氧酶(IDO)基因的表達(dá)。
　　 結(jié)果：(1)ASC 上清對T 淋巴細(xì)胞的增殖和凋亡無明顯影響。ASC 對T 淋巴細(xì)胞的生長有抑制作用，但對其凋亡無影響。ASC 上清和ASC 均能增加CD4+CD25+T 細(xì)胞在T 淋巴細(xì)胞中的比例，增加T 細(xì)胞分泌IL-10和TGF-β1的水平，上調(diào)FOXP3基因的表達(dá)。
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