免疫細胞遷移試驗評價生物材料免疫原性的探索性研究.pdf

1、在大面積燒傷患者的皮膚移植過程中所需的自體皮源十分有限，而異體或異種皮移植又存在排異反應(yīng)。異基因組織工程皮膚因其具有來源廣泛，促進再生等特點在燒傷治療中有良好的臨床應(yīng)用前景，已成為近年來創(chuàng)面修復(fù)研究的熱點之一。然而如何克服免疫排斥反應(yīng)是異基因組織器官移植面臨的重大挑戰(zhàn)。組織工程醫(yī)療產(chǎn)品的安全性問題一直受到國內(nèi)外食品藥品監(jiān)督局及衛(wèi)生管理機構(gòu)的重視，尤其是其產(chǎn)品用于人體之前的生物學(xué)評價。因此，從多個角度客觀評價其產(chǎn)品的免疫原性是醫(yī)用生物材料

2、研發(fā)的重大需求。本課題就從細胞遷移的角度分析評價組織工程醫(yī)療產(chǎn)品的免疫原性。通過檢測細胞趨化活性，探索一種評價生物材料的免疫原性的實驗方法，為評價研發(fā)的新型組織工程皮膚材料的免疫原性提供新方法及理論依據(jù)。
　　 目的
　　 1.通過兔血淋巴細胞的遷移試驗，檢測刺激劑對淋巴細胞的劑量效應(yīng)，初步建立一種兔淋巴細胞遷移試驗評價生物材料免疫原性的實驗方法。
　　 2.再次通過檢測小鼠脾臟淋巴細胞的遷移，并初步建立由細胞遷

3、移試驗評價材料免疫原性的實驗方法；
　　 3.基于本實驗室前期探索的朗格漢斯細胞體外誘導(dǎo)方案，采用掃描電鏡和透射電鏡觀察朗格漢斯細胞形態(tài)及CD196和CD86的表型鑒定，篩選出朗格漢斯細胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的最佳方案，預(yù)期為探索朗格漢斯細胞遷移試驗提供效應(yīng)細胞。
　　 方法
　　 1.不同刺激劑作用下的兔淋巴細胞遷移試驗
　　 1.1取新西蘭大耳白兔(雌雄不限)靜脈血，采用密度梯度離心法分離出淋巴細胞，用PHA

4、和ConA分別作為淋巴細胞分泌趨化因子的刺激劑。在細胞懸液中，加入不同濃度的刺激劑，置37℃含5%CO2的孵箱中生長培養(yǎng)72小時，收集細胞上清。
　　 1.2將細胞上清作為趨化因子的來源，誘導(dǎo)兔淋巴細胞遷移，用Transwell法測定其細胞遷移率，比較各種刺激劑的遷移效果，了解不同刺激劑的淋巴細胞遷移效應(yīng)。
　　 2.不同刺激劑作用下的小鼠淋巴細胞遷移試驗
　　 2.1.取BALB/c小鼠(雌雄不限)脾臟，采用研

5、磨法分離淋巴細胞，分別用PHA、ConA和CD3ε單克隆抗體作為淋巴細胞分泌趨化因子的刺激劑。在細胞懸液中，加入不同濃度刺激劑，置37℃含5%CO2的孵箱中生長培養(yǎng)72小時，收集細胞上清。
　　 2.2將細胞上清作為趨化因子的來源，誘導(dǎo)小鼠淋巴細胞遷移，用Transwell法測定其細胞遷移率，比較各種刺激劑的遷移效果。了解其刺激劑的淋巴細胞遷移效應(yīng)。
　　 3.不同生物材料浸提液作用下的小鼠淋巴細胞遷移試驗
　　

6、 3.1制備生物材料浸提液：(1)可溶性材料，選取牛Ⅰ型膠原，將之溶解于純度>99.5%的乙酸溶液，小量分裝，保存于4℃。(2)不溶性材料，選取脫細胞凍干牛真皮，將其稱量后，按比例浸泡于RPMI-1640，孵育24小時，收集其浸提液，小量分裝保存于-20℃。
　　 3.2取BALB/c小鼠(雌雄不限)脾臟，采用研磨法分離淋巴細胞，分別用生物材料浸提液作為淋巴細胞分泌趨化因子的刺激劑。在細胞懸液中，加入不同濃度材料浸提液，置37℃

7、含5%CO2的孵箱中生長培養(yǎng)72小時，收集細胞上清。
　　 3.3將細胞上清作為趨化因子的來源，誘導(dǎo)小鼠淋巴細胞遷移，用Transwell法測定細胞遷移率，比較各種材料浸提液的遷移效果。了解其材料的淋巴細胞遷移效應(yīng)。
　　 4.小鼠淋巴細胞上清中趨化因子濃度水平的測定
　　 4.1取BALB/c小鼠(雌雄不限)脾臟，采用研磨法分離淋巴細胞，分別用PHA、ConA和CD3ε單克隆抗體作為淋巴細胞分泌趨化因子的刺激劑

8、。在細胞懸液中，加入不同濃度刺激劑，置37℃含5%CO2的孵箱中生長培養(yǎng)72小時，收集細胞上清。
　　 4.2酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)：在酶標儀上檢測刺激劑作用小鼠淋巴細胞后的細胞上清中趨化因子XCL1、CCL4、CCL5、CCL3、IL-16、IL-8及CCL20對應(yīng)的OD450值，計算出各趨化因子的濃度水平。
　　 5.朗格漢斯細胞的體外誘導(dǎo)實驗
　　 5.1先用人淋巴細胞分離液得到臍血單個核細胞，以C

9、D34直接免疫磁珠法對臍血單個核細胞進行直接標記，分選和純化臍血單個核細胞中的CD34+細胞。
　　 5.2以5種不同的細胞因子組合誘導(dǎo)方案，對分選出的CD34+細胞進行體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，通過掃描電鏡和透射電鏡觀察其細胞生長形態(tài)。
　　 5.3結(jié)合本實驗室已有的表型鑒定的數(shù)據(jù)，再用流式細胞儀對其進行CD196及CD86表型鑒定，篩選出最佳的LC體外誘導(dǎo)方案。
　　 結(jié)果
　　 1.兔淋巴細胞遷移試驗中，PHA

10、和ConA對應(yīng)的細胞遷移率，均和陰性對照有顯著差異。其中，PHA組的刺激濃度為5μg/ml時，其對應(yīng)的淋巴細胞遷移率明顯高于對照組；ConA組的刺激濃度為5、10μg/ml時，其對應(yīng)的淋巴細胞遷移率明顯高于對照組。
　　 2.小鼠淋巴細胞遷移試驗中，PHA組對應(yīng)的細胞遷移率和對照組無明顯差異；ConA和CD38對應(yīng)的細胞遷移率，均和陰性對照有顯著差異。其中，ConA組的刺激濃度為20μg/ml時，其對應(yīng)的淋巴細胞遷移率明顯高于對

11、照組；CD3ε組，其濃度分別為2.5和10μg/ml時，對應(yīng)的淋巴細胞遷移率明顯高于對照組。
　　 3.牛Ⅰ型膠原溶解液，其細胞遷移率和陰性對照有顯著差異。其中，當濃度為5和10μg/ml時，對應(yīng)的淋巴細胞遷移率和對照組有明顯差異；當其濃度分別為100、200和300μg/ml時，對應(yīng)的淋巴細胞遷移率和對照組有非常顯著的差異。
　　 4.脫細胞牛真皮浸提液，作用于淋巴細胞，其對應(yīng)的四個濃度的細胞遷移率和對照組均無明顯差異

12、。
　　 5.在各個刺激劑組中，ELISA測得的多種趨化因子水平在總體上存在明顯差異。趨化因子XCL1、CCL4、CCL5、CCL3的水平明顯高于對照，說明這幾個因子在淋巴細胞遷移中起到重要的作用。趨化因子IL-16、IL-8及CCL20的水平和對照無明顯差異。
　　 6.通過掃描電鏡和透射電鏡的結(jié)果，結(jié)合已有的表型鑒定的數(shù)據(jù)，可知方案Ⅳ為最佳方案。
　　 結(jié)論
　　 1.兔淋巴細胞遷移試驗中，PHA和C

13、onA均能誘導(dǎo)淋巴細胞遷移，其遷移率和對照組有顯著差異。
　　 2.小鼠淋巴細胞遷移試驗中，PHA對淋巴細胞遷移無增強作用；ConA和CD3ε均能誘導(dǎo)淋巴細胞遷移，其遷移率和對照組有顯著差異。
　　 3.PHA、ConA及CD3ε均誘導(dǎo)淋巴細胞分泌不同濃度水平的趨化因子。
　　 4.牛Ⅰ型膠原溶解液對小鼠淋巴細胞遷移有增強作用，脫細胞牛真皮浸提液對小鼠淋巴細胞遷移無增強作用。
　　 5.通過掃描電鏡及透射