NK細胞介導的抗HBV感染免疫作用及其機制研究.pdf

1、背景:乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是當前嚴重社會公共衛(wèi)生問題。據(jù)WHO統(tǒng)計，全球約20億人曾感染過HBV，其中2.4億人為慢性HBV感染者，每年大約100萬人死于HBV感染相關終末期肝病，因而成為當前醫(yī)學界關注焦點之一。我國2006年HBV感染血清流行病學調查結果表明，1～59歲一般人群HBsAg攜帶率為7.18％，據(jù)此推算我國現(xiàn)有慢性HBV感染者約9300萬例，慢性乙型肝炎(chronic hepat

2、itis B，CHB)患者約2000萬例，其中15％～40％將可能死于肝衰竭、失代償期肝硬化和原發(fā)性肝癌等終末期肝病，嚴重威脅國民的健康。CHB發(fā)病機制復雜，迄今尚存在諸多問題有待深入。近年來，隨著對CHB免疫機制認識深入，國內外學者普遍認為:HBV病毒本身并非造成肝細胞損害的首要原因，而病毒感染細胞誘發(fā)機體產(chǎn)生的一系列免疫清除反應才是造成CHB病理損傷的核心環(huán)節(jié)。因此，宿主免疫狀態(tài)是影響HBV感染后疾病轉歸的關鍵因素之一，有效調節(jié)宿主

3、免疫功能，加強機體對HBV感染肝細胞的特異性識別，抑制甚或清除HBV并實現(xiàn)持久的免疫控制成為目前實現(xiàn)CHB理想治療目標的重要策略。
　　 傳統(tǒng)觀念認為，CD8+細胞毒性T細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）通過特異性殺傷機制在誘發(fā)組織免疫病理損傷、特異性清除HBV環(huán)節(jié)占據(jù)主導地位，但近來研究發(fā)現(xiàn)以自然殺傷細胞(natural killer cells，NK cells)、NKT細胞為首的非特異性免疫反應在

4、防御甚至清除HBV感染過程中亦發(fā)揮重要作用。尤其當HBV特異性CTL不足以清除病毒情況下，肝臟招募大量NK細胞向肝內聚集、活化。在這一過程中:CXC家族趨化因子干擾素-γ誘導蛋白-10(interferon gamma inducible protein 10 kD,IP-10)作為肝臟募集NK細胞關鍵趨化因子，必然對NK細胞在器官、組織中重分布，以及NK細胞所介導的抗病毒免疫應答發(fā)揮重要調節(jié)作用;另一方面，以NKG2D為代表的NK細胞

5、膜受體活化在介導突破HBV感染后免疫耐受、啟動非特異性和/或特異性免疫清除等環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用。因此，研究HBV感染者肝內NK細胞募集、活化的機制及其信號通路，對明確HBV感染后慢性化/重癥化機制，探尋抗HBV免疫調控靶點、強化免疫調節(jié)療效等均具有重要現(xiàn)實意義。
　　 目的:通過檢測慢性HBV攜帶者(chronic HBV carriers，AsC)、慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）和HBV相關慢加急

6、性肝衰竭（HBV related acute-on-chronic liver failure，HBV-ACLF）患者外周血、肝組織中NK細胞數(shù)量、活性;NK細胞膜受體NKG2D及胞內IFN-γ陽性表達;血清、細胞培養(yǎng)上清液中NK細胞效應分子IFN-γ、TNF-α、穿孔素、顆粒酶B表達，以及NK細胞趨化因子IP-10表達及其與肝組織炎癥損傷、NK細胞聚集、HBV復制的關系等，探討慢性HBV感染不同臨床階段NK細胞介導的免疫差異，證實NK

7、細胞在介導慢性HBV感染者免疫活化、病理損傷、肝炎重癥化等方面的作用與機制。另一方面，通過對臨床聚乙二醇干擾素α(pegylated interferon alpha，Peg IFN-α)抗病毒治療CHB患者的隊列研究，觀察NK細胞活化、IP-10基線表達與動態(tài)變化等對抗病毒治療應答的影響，初步評估NK細胞相關指標對干擾素抗病毒治療應答的預測價值，并結合PegIFN-α聯(lián)合阿德福韋酯(adefovir dipivoxil，ADV)抗病毒

8、治療臨床療效觀察，為CHB患者探求免疫調控靶點及臨床優(yōu)化抗病毒策略提供實驗基礎和理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1、NKG2D介導NK細胞活化對慢性HBV感染者免疫激活及重癥化影響
　　 依據(jù)我國2010年《慢性乙型肝炎防治指南》、2006年《肝衰竭診療指南》診斷、分型標準，入選AsC、CHB、HBV-ACLF患者各15例，同期篩選15例健康獻血員作為健康對照組(healthy controls，HC)。所有納患

9、者入組前6月均未曾接受過免疫調節(jié)、抗病毒及乙肝疫苗治療;排除HAV、HCV、HEV、EBV、CMV、HIV等合并感染;無合并酒精、藥物、代謝性、免疫性肝病及惡性腫瘤等。全自動生化分析儀測定血清白蛋白(albumin，Alb)、丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)、總膽紅素(total bilirubin，TBil)等;酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assa

10、y，ELISA)檢測血清IFN-γ、TNF-α、穿孔素、顆粒酶B水平;實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time PCR)檢測血清HBVDNA載量;電化學發(fā)光法(electrochemiluminescence，ECL)定量檢測HBsAg、HBeAg滴度。分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，流式細胞術(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測NK（CD3-CD56

11、+）細胞、NKG2D+NK細胞頻率，胞內因子染色法檢測IFN-γ+NK細胞頻率。肝組織標本蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，觀察炎癥、壞死程度;免疫組織化學（immunohi stochemistry，IHC）染色觀察NK(CD3-CD57+)細胞分布、數(shù)量，NKG2D+、IFN-γ+細胞表達;RealtimePCR檢測NKG2D、IFN-γmRNA表達。
　　 2、NKG2D信號通路在TNF-α誘導

12、NK細胞活化殺傷HBV復制靶細胞機制中的作用
　　 復蘇HepG2細胞以含10％胎牛血清、1％青鏈霉素的HG-DMEM培養(yǎng)基于5％CO2，37℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期，接種于六孔板中，每孔5×105個細胞，至60％～70％細胞融合時更換新鮮完全培養(yǎng)基，以VigoFect高效轉染試劑盒進行質粒轉染，24h后收集轉染細胞（HBV-HepG2細胞），傳代培養(yǎng)，收集細胞上清液Real-timePCR測定HBVDNA載量，驗證轉染效果，并篩選H

13、BVDNA≥5.0×106拷貝/ml細胞進入后續(xù)實驗。同期復蘇NK-92細胞，以含12.5％胎牛血清、12.5％馬血清、200IU/mlIL-2、0.5ng/mlIL-15的α-MEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)、傳代，MTT法驗證NK-92細胞殺傷活性，而后分組干預:單細胞培養(yǎng)組、單細胞培養(yǎng)干預組、聯(lián)合培養(yǎng)組、聯(lián)合培養(yǎng)干預組。經(jīng)24h處理后，收集細胞及培養(yǎng)上清液。ELISA檢測上清液中TNF-α、IFN-γ、穿孔素、顆粒酶B水平，Real-time

14、PCR定量檢測HBVDNA載量。
　　 3、干擾素-γ誘導蛋白-10募集NK細胞肝臟遷移對CHB抗病毒應答影響
　　 橫斷面研究:病例篩選，血清ALT水平、HBVDNA載量，PBMCs中NK細胞頻率、肝組織炎癥活動度（inflammation activity，IA）積分等同第一部分。另外，ELISA法檢測血清IFN-γ及其誘導蛋白-10(interferon gamma inducible protein 10 kD，

15、IP-10)水平;IHC染色觀察肝組織IFN-γ、IP-10陽性表達;RealtimePCR檢測肝組織IFN-γ、IP-10mRNA表達。
　　 隊列研究:納入2010年1月～2011年12月接受PegIFNα抗病毒治療CHB患者60例，入選病例符合2010年《慢性乙型肝炎防治指南》標準，同時滿足下列條件:18～65歲;HBVDNA≥104拷貝/ml;80U/L＜ALT＜400U/L，和/或經(jīng)肝組織病理證實炎癥分級≥G2;6個月

16、內未曾接受過抗病毒、免疫調節(jié)劑及乙肝疫苗治療。排除妊娠及哺乳期女性，無HAV、HCV、HEV或HIV合并感染，無惡性腫瘤、自身免疫性疾病、未控制的糖尿病、甲狀腺疾病，既往精神病史，或其他系統(tǒng)嚴重疾病、干擾素用藥禁忌等情況。收集患者抗病毒治療前、治療中、停藥隨訪期血清，用于ALT、AST、HBVDNA、HBsAg、HBeAg及細胞因子IFN-γ、IP-10動態(tài)監(jiān)測;收集部分患者治療前、后肝穿刺組織標本，進行組織病理及分子生物學檢測（檢測指

17、標及方法同橫斷面研究）。
　　 4、Peg IFN-α2a聯(lián)合ADV個體化治療提高HBeAg陽性CHB患者抗病毒療效
　　 本隊列研究納入符合干擾素抗病毒治療HBeAg陽性CHB患者160例（納入與排除標準同前）。所有患者1∶1比例隨機分配進入干擾素標準治療組和個體化治療組。標準治療組患者接受PegIFNα-2a標準治療，個體化治療組又依據(jù)患者基線HBVDNA載量和/或肝纖維化程度亞分為初始PegIFNα-2a與ADV聯(lián)

18、合治療組（38例，HBV＞1.0×107copies/ml和/或肝纖維化≥S3）和初始PegIFNα-2a單藥治療組（42例）。治療24周后，對個體化治療組療效初評，并依據(jù)抗病毒應答重新分組:對HBVDNA低于檢測下限、HBeAg清除及ALT復?；颊?，繼續(xù)（或調整為）PegIFNα-2a單藥治療，余者均繼續(xù)（或調整為）PegIFNα-2a聯(lián)合ADV治療至療程結束。所有患者均接受至少48周抗病毒治療，并隨訪至96周，常規(guī)檢測生化學、病毒學

19、、血清學等指標及血常規(guī)、肝腎功能、甲狀腺功能等，動態(tài)觀察患者抗病毒治療療效、安全性、耐藥率及停藥復發(fā)率等。
　　 結果:
　　 1、NKG2D介導NK細胞活化對慢性HBV感染者免疫激活及重癥化影響
　　 1.1、人口基線特征與血清指標特點:
　　 各組患者在年齡構成、性別比例具有可比性。HBV-ACLF患者血清ALT、TBil水平均顯著高于、PTA水平顯著低于CHB及AsC患者（均P＜0.01）。與CHB

20、患者相比，HBV-ACLF患者HBVDNA載量、HBeAg滴度偏低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01或＜0.05）。
　　 1.2、血清IFN-γ、TNF-α、穿孔素、顆粒酶B水平變化:
　　 HBV-ACLF組患者血清IFN-γ（10.78±1.19pg/ml）、TNF-α(118.25±25.36pg/ml)水平均顯著高于CHB組（6.98±1.12pg/ml;69.54±17.35pg/ml）、AsC組（2.24±

21、0.45pg/ml;26.25±6.37pg/ml），兩兩比較各組差異均具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）。各組血清IFN-γ、TNF-α水平以健康對照組（1.98±0.58pg/ml;24.58±6.15pg/ml）最低，但與AsC組比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。
　　 血清穿孔素、顆粒酶B變化趨勢與IFN-γ一致，以HBV-ACLF組最高（5.96±1.89ng/ml;12.56±2.28pg/ml），其后依次為CHB組（

22、2.75±0.58ng/ml;3.52±0.96pg/ml）、AsC組（1.58±0.59ng/ml;2.34±0.65pg/ml）和健康對照組（1.58±0.42ng/ml;2.25±0.48pg/ml），除AsC組與健康對照組比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），其它各組兩兩比較具差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01或＜0.05）。
　　 1.3、外周血CD3-CD56+(NK)細胞，NKG2D+與IFN-γ+NK細胞頻率比較:<

23、br>　　 與健康對照組（13.58±3.24）％相比，慢性HBV感染各組PBMCs中CD3-CD56+(NK)細胞頻率均不同程度降低，以AsC組（5.42±2.18）％最低。CHB組（8.43±2.92）％、HBV-ACLF（7.92±2.85）％組患者NK細胞頻率較AsC患者不同程度升高，差異均具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），但仍顯著低于健康對照組水平（均P＜0.01），而HBV-ACLF與CHB組患者NK細胞頻率比較無統(tǒng)計學差

24、異（P＞0.05）。
　　 與NK細胞頻率趨勢不同，NKG2D+和IFN-γ+NK細胞占全部NK細胞比例以ACLF組患者[（18.92±5.85）％;（42.25±10.17）％]最高，其后依次為CHB組[（12.85±3.39）％;（27.95±6.12）％]、健康對照組[（8.45±2.86）％;（18.69±5.68）％]及AsC組[（3.36±1.05）％;(12.55±3.24)％]，各組間兩兩比較差異均具有統(tǒng)計學意義

25、（P＜0.01或＜0.05）。
　　 1.4、肝組織CD3-CD57+NK細胞，及NKG2D+、IFN-γ+細胞的表達:
　　 CHB與HBV-ACLF患者CD3-CD57+NK細胞呈彌漫分布，以淋巴細胞密集的匯管區(qū)、炎癥壞死區(qū)明顯，在健康對照組及AsC患者極少數(shù)陽性表達NK細胞散在分布于肝竇內及匯管區(qū)。半定量分析顯示，HBV-ACLF患者肝組織浸潤的CD3-CD57+NK細胞(19.6±3.5/hpf)顯著多于CHB組

26、(8.4±3.5/hpf)、AsC組(2.5±1.3/hpf)和健康對照組(1.2±0.6/hpf)，除AsC與健康對照組比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），其余各組兩兩比較差異均具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。
　　 NKG2D+細胞主要分布于淋巴細胞聚集的炎癥壞死區(qū)。IFN-γ在健康對照組與AsC患者主要表達于個別肝細胞，而在HBV-ACLF與CHB患者同樣以炎癥壞死區(qū)浸潤的淋巴細胞表達為著。半定量分析顯示NKG2D+、IF

27、N-γ+細胞均以HBV-ACLF組表達最強、AsC組最弱，各組間兩兩比較差異均具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）。
　　 1.5、肝組織中NKG2D、IFN-γmRNA表達變化:
　　 將健康對照組肝組織中NKG2D、IFN-γmRNA相對表達量設定為1.00。HBV-ACLF患者肝組織NKG2D（6.58±1.86）、IFN-γ（3.56±0.63）mRNA相對表達量最高，其后依次為CHB組（3.25±0.95;1.54

28、±0.33）和AsC組（0.69±0.20;0.52±0.09），各組間兩兩比較差異均具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）。AsC組患者肝組織中NKG2D、IFN-γmRNA相對表達量均低于健康對照組，且差異具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。
　　 2、NKG2D信號通路在TNF-α誘導NK細胞活化殺傷HBV復制靶細胞機制中的作用
　　 2.1、質粒轉染成功制備HBV復制型肝細胞:
　　 利用野生型HBV質粒轉染He

29、pG2細胞，篩選高復制HBVDNA細胞株（HBV-HepG2）。RealtimePCR檢測HBV-HepG2細胞上清液中HBVDNA載量1.0×105-1.0×107拷貝/ml，ELISA法檢測上清液HBsAg陽性，轉染HBV-HepG2細胞釋放IFN-γ、TNF-α水平較未轉染的HepG2細胞輕度升高，但差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。
　　 2.2、NK細胞殺傷活性:
　　 經(jīng)IL-2與IL-15誘導維持生長的N

30、K-92細胞具有低水平殺傷活性，IFN-α刺激后，殺傷活性明顯增強，尤其對于HBV-HepG2細胞殺傷活性更強。應用特異性單克隆抗體封閉NKG2D受體后，NK細胞對靶細胞殺傷活性減低，尤其對經(jīng)IFN-α誘導活化NK細胞的殺傷活性下降更為顯著，與對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或＜0.01）。
　　 2.3、NK細胞對HBV-HepG2中HBVDNA載量的影響:
　　 應用單獨培養(yǎng)HBV-HepG2細胞，上清液中

31、HBVDNA載量略有下降。未經(jīng)IFN-α干預的NK細胞與HBV-HepG2細胞聯(lián)合培養(yǎng)上清液中HBVDNA也僅輕微下降(P＞0.05)，但經(jīng)IFN-α干預后聯(lián)合培養(yǎng)上清液中HBVDNA載量下降顯著(P＜0.05)。NKG2DmAb可部分阻斷NK細胞對HBV復制的抑制效應，尤其阻斷經(jīng)IFN-α誘導活化NK細胞對HBV復制的抑制效應(P＜0.05)。
　　 2.4、細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IFN-γ、穿孔素、顆粒酶B含量變化:<

32、br>　　 IL-2與IL-15誘導維持生長的NK-92細胞培養(yǎng)上清液可檢測出低水平TNF-α、IFN-γ、穿孔素、顆粒酶B。經(jīng)IFN-α刺激后上述指標不同程度增加（P＜0.05或＜0.01），以IFN-γ升高最著。聯(lián)合培養(yǎng)組上清液TNF-α、IFN-γ、穿孔素、顆粒酶B水平均較單獨培養(yǎng)組升高（均P＜0.01），且經(jīng)IFN-α刺激后較未經(jīng)IFN-α刺激的聯(lián)合培養(yǎng)組和經(jīng)IFN-α刺激的單獨培養(yǎng)組均顯著升高（均P＜0.01）。應用NKG2

33、DmAb封閉可以顯著抑制IFN-α對上述指標的上調效應，差異具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），但NKG2DmAb阻斷未能將上述指標恢復至干預前水平。
　　 3、干擾素-γ誘導蛋白-10募集NK細胞肝臟遷移對CHB抗病毒應答影響
　　 3.1、各組人口基線特征及血清指標特點:
　　 健康對照組、AsC及HBV-ACLF組患者人口基線特征、血清生化學及病毒學指標特點同第一部分(1.1)。另外60例前瞻隊列研究CHB患

34、者，平均年齡37±12(16～65)歲。其中38例HBeAg陽性、22例HBeAg陰性，兩亞組間在年齡分布、性別比例方面均具有可比性(P＞0.05)。
　　 3.2、抗病毒治療CHB患者生化學、病毒學及血清學應答特點:
　　 所有CHB患者均至少完成48周PegIFN-α抗病毒治療，并于停藥后隨訪48周。至隨訪結束，76.67％(46/60)患者ALT復常，65.00％(39/60)HBVDNA低于檢測下限（＜500拷貝

35、/ml）。58.33％(35/60)HBsAg下降＞1log10IU/ml，其中23例患者治療前為HBeAg陽性、12例HBeAg陰性，僅8.33％(5/60)患者發(fā)生HBsAg清除。38例HBeAg陽性患者60.53％(23/38)實現(xiàn)HBeAg清除，其中20例同時出現(xiàn)HBeAg血清學轉換。
　　 3.3、各組血清IP-10、IFN-γ基線水平:
　　 HBV-ACLF與CHB組患者血清IP-10、IFN-γ基線水平明

36、顯高于AsC和健康對照組（均P＜0.01），且以HBV-ACLF組最高，并與CHB組比較差異亦具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，但AsC與健康對照組比較無統(tǒng)計學差異。HBeAg陽性患者血清IP-10水平高于HBeAg陰性患者（P＜0.01）。回顧性分析顯示HBeAg清除、HBsAg下降＞1log10IU/ml患者較HBeAg持續(xù)陽性及HBsAg下降＜1log10IU/ml患者基線IP-10水平更高，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

37、r>　　 3.4、CHB患者抗病毒治療過程中血清IP-10動態(tài)變化:
　　 伴隨抗病毒治療血清IP-10水平逐漸下降，尤其以HBeAg清除、HBsAg下降＞1log10IU/ml患者下降更為明顯，不僅顯著低于治療基線水平(P＜0.01)，其下降幅度與HBeAg持續(xù)陽性、HBsAg下降＜1log10IU/ml患者相比同樣具有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。不僅如此，對HBsAg下降＞1log10IU/ml組患者IP-10動態(tài)監(jiān)測

38、顯示IP-10下降曲線與HBsAg下降曲線高度一致，尤其是在抗病毒治療期間。
　　 3.5、各組肝組織IP-10mRNA和蛋白表達差異:
　　 將健康對照者肝組織IP-10mRNA表達量設定為1.00，以HBV-ACLF患者肝組織IP-10mRNA相對表達量最高（8.51±0.64），顯著高于CHB組（4.01±0.74）和AsC組（1.04±0.03），各組間比較差異具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01或＜0.05）。IP-

39、10蛋白表達趨勢與mRNA一致，也以ACLF患者最高，其后依次為CHB、AsC和健康對照組。除AsC和健康對照組比較無統(tǒng)計學差異外，其余各組兩兩比較差異均具有統(tǒng)計學意義。此外，HBeAg陽性CHB患者肝組織IP-10mRNA、蛋白表達水平亦高于HBeAg陰性患者(P＜0.01)。
　　 3.6、血清IP-10水平與血清ALT、HBVDNA、HBsAg定量，PBMCs中IFN-γ+NK頻率，肝組織IA積分、IFN-γ+細胞表達相關

40、性分析:
　　 血清IP-10水平與肝組織IP-10mRNA、蛋白表達相關性良好。治療前IP-10水平與血清ALT水平、PBMCs中IFN-γ+NK頻率、肝組織IA積分及IFN-γ+細胞表達均呈正相關（r=0.65，0.60，0.77，0.64，P＜0.01），而與血清HBVDNA載量、HBsAg滴度呈負相關（r=-0.69，-0.59，P＜0.01）
　　 3.7、基線高IP-10水平(＞350pg/ml)對PegIF

41、N-α抗病毒治療HBeAg清除與HBsAg下降的預測價值:
　　 Logistic多元回歸分析顯示，治療前高IP-10水平(OR，6.068;95％CI,1.274-28.902)、ALT水平(OR,3.745;95％CI,0.826-16.983)是HBeAg清除的獨立預測因素。同樣高水平IP-10(OR，4.677;95％CI，1.102-19.841)、ALT(OR,3.186;95％CI,0.842-12.048)，以及

42、低HBVDNA載量(OR，0.364;95％CI，0.131-1.013)是HBsAg下降的獨立預測因素。相比而言，IP-10較其它指標具有更強的預測效力。
　　 4、PegIFN-α2a聯(lián)合ADV個體化治療提高HBeAg陽性CHB患者抗病毒療效
　　 4.1、病毒學應答:
　　 治療24周，個體化治療組僅8.75％(7/80)患者HBVDNA載量較治療前無下降，其中1例在初始聯(lián)合治療組、6例在初始PegIFNα

43、-2a單藥治療組。雖然低于標準治療組16.25％(13/80)，但無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。48周治療結束時，個體化治療組72.50％(58/80)患者HBVDNA低于檢測下限，高于標準治療組53.75％(43/80)，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。隨訪期間，兩組患者HBVDNA反彈率分別為18.97％(11/58)和11.63％(5/43)。至隨訪結束后，兩組HBVDNA低于檢測下限率分別降至58.75％(47/80)和47

44、.50％(38/80)，兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 4.2、生化學應答:
　　 治療24周時，個體化治療組ALT復常率57.50％(46/80)，包括初始聯(lián)合治療組25例，初始單藥治療組21例，高于標準治療組40.00％(32/80)（P＜0.05）。但至隨訪結束時，兩組ALT復常率分別升至78.75％(63/80)和71.25％(57/80)，差異比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　

45、 4.3、HBeAg血清學轉換率與HBsAg消失率:
　　 48周治療結束時，個體化治療組HBeAg清除率、血清轉換率及HBsAg消失率分別為63.75％、56.25％和15.00％，而標準治療組僅分別為45.00％、37.50％和8.75％，兩組在HBeAg清除與血清轉換率方面比較差異均具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。隨訪結束時，個體化治療組HBeAg血清轉換率及HBsAg消失率分別調至53.75％和17.50％，高于標準治

46、療組32.50％和10.00％，但僅HBeAg血清轉換率在兩組間比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。此外，全部患者中38.75％(62/160)獲得聯(lián)合應答（HBVDNA低于檢測下限、HBeAg清除或血清學轉換，或伴有HBsAg消失），其中38例為個體化治療組、24例為標準治療組患者。
　　 4.4、安全性評估
　　 全部患者中無因不良反應退出試驗者，僅1例患者因A181V位點突變調整為替比夫定治療。其中2例患者出現(xiàn)

47、三碘甲狀腺原氨酸、甲狀腺素升高，同時伴隨促甲狀腺素下降。經(jīng)減量PegIFNα-2a劑量后各指標逐漸恢復至正常。15例患者因粒細胞顯著降低下調PegIFNα-2a用量，但未出現(xiàn)因不良反應而致ADV減量或停藥事件。3例患者治療后二次肝穿發(fā)現(xiàn)肝纖維化程度加重，但臨床無失代償期肝病及死亡病例發(fā)生。
　　 結論:
　　 1、慢性HBV感染者不同臨床階段NK細胞頻率、活性、分布存在差異，提示以NK細胞為代表的固有免疫應答參與HBV感

48、染后宿主免疫調節(jié)，并影響疾病進展與轉歸。
　　 2、NK細胞在肝臟內募集、活化，參與肝臟免疫炎癥損傷，其機制部分依賴于NK細胞膜受體NKG2D活化以及合成、分泌IFN-γ、TNF-α、穿孔素、顆粒酶B等效應分子能力。
　　 3、質粒轉染成功制備HBV復制肝細胞模型，通過與NK細胞聯(lián)合培養(yǎng)證實NK細胞對靶細胞的非特異殺傷活性，且IFN-α可能通過上調NKG2D受體活化及促進IFN-γ分泌強化NK細胞抗病毒效應。
　　

49、 4、體外阻斷NKG2D信號通路能有效抑制NK細胞效應分子合成、釋放，下調NK細胞對靶細胞殺傷活性，反證NKG2D是介導NK細胞抗HBV感染免疫的重要信號通路之一。
　　 5、IP-10作為NK細胞重要趨化因子，參與HBV-ACLF患者外周NK細胞向肝內遷移、聚集，并與肝組織炎癥活動度相關，提示有效調節(jié)IP-10可減輕由NK細胞所介導的肝臟免疫病理損傷。
　　 6、IP-10基線水平及動態(tài)演變與PegIFN-α抗病毒應