慢性HBV感染者外周血HBV特異性CTL、NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞穿孔素表達(dá).pdf

1、背景:我國是HBV感染的高發(fā)區(qū)，約有9300萬慢性HBV感染者。HBV感染可引起不同的臨床結(jié)果，包括急性乙肝、慢性HBV攜帶、慢性乙肝、肝衰竭、肝硬化和肝細(xì)胞癌等，其原因主要決定于機(jī)體的免疫應(yīng)答狀態(tài)。人體肝臟含有大量的天然免疫細(xì)胞如NK細(xì)胞(naturalkillercells，NK)、NKT(naturalkillerTlymphocytes，NKT)細(xì)胞等，約占整個肝臟淋巴細(xì)胞的2/3。其中NK細(xì)胞約占30％，NKT細(xì)胞也近30%，

2、而適應(yīng)性免疫T淋巴細(xì)胞亞群僅占30%左右。穿孔素(perforin，又稱pore-formingprotein，PFP)是由細(xì)胞毒性細(xì)胞:NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞及細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxicTlymphocytes，CTL)分泌的效應(yīng)分子，能在靶細(xì)胞上形成跨膜的孔道，使顆粒酶進(jìn)入靶細(xì)胞胞漿，由此啟動凋亡信號通路，引起肝細(xì)胞損害。因此，NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞和CTL細(xì)胞在HBV感染的清除和免疫導(dǎo)致病理損傷的作用需進(jìn)一步明確。

3、　　 目的:研究慢性HBV感染患者外周血HBV特異性CTL、NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞的頻數(shù)、穿孔素量的表達(dá)，與血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平、HBV載量的相關(guān)性，探討慢性HBV感染患者血HBV特異性CTL、NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞的免疫學(xué)特點及其介導(dǎo)肝損傷的機(jī)制。
　　 方法:研究對象為2011年9月至2012年3月蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院感染病科門診和住院HBV感染患者70例和健康對照者10例:其中乙肝病毒攜帶者15例，慢型乙型肝炎(chro

4、nicHBVhepatitisCHB)患者30例（輕度CHB6例、中度CHB9例、重度CHB15例），HBV相關(guān)性慢加急性肝衰竭(Acute-on-chronicliverfailureSACLF)25例。免疫組化分析表達(dá)穿孔素的外周血淋巴細(xì)胞;用SYBRGreenI實時熒光定量PCR方法檢測患者外周血單個核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcells，PBMCs)中PFPmRNA的含量;流式細(xì)胞術(shù)分別檢測NK、

5、NKT、CTL、HBV特異性CTL細(xì)胞的頻數(shù)及其PFP蛋白表達(dá)量。實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測血清HBVDNA載量，美國BeckmanCX-V型全自動生化檢測儀檢測血清ALT水平。
　　 結(jié)果:1.健康對照組、HBV攜帶、CHB、及SACLF外周血NK細(xì)胞的比例分別是21.47%±13.2%、20.19%±8.08%、11.87%±6.15%及5.18%±3.69%，SACLF患者和CHB患者較健康對照組、乙肝病毒攜帶

6、明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;外周血NKT的比例分別是18.16%±9.33%、20.79%±3.5%、14.28%±6.74%及8.48%±4.14%，SACLF患者和CHB患者較健康對照組、乙肝病毒攜帶明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;非特異性CTL細(xì)胞的比例分別是18.5%±1.85%、17.72%±5.89%、23.96%±5.39%及28.83%±5.02%，SACLF患者和CHB患者較健康對照組、乙肝病毒攜帶明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意

7、義;HBV特異性CTL的比例分別:0.056%±0.038%、0.065%±0.053%、0.75%±0.36%及0.45%±0.14%，CHB比攜帶者及對照組明顯升高差異有統(tǒng)計學(xué)意義，SACLF與CHB無差異。
　　 2.CHB患者NK、NKT、CTL、HBV特異性CTL細(xì)胞的頻數(shù)與血清ALT的關(guān)系:HBV特異性CTL細(xì)胞的頻數(shù)與ALT相關(guān)系數(shù)r=0.322，P＜0.05;NK、NKT、CTL與血清ALT成正相關(guān)相關(guān)系數(shù)分別為

8、:r1=0.656(P1＜0.01)，r2=0.57(P2＜0.01)，r3=0.637(P3＜0.01)。
　　 3.慢性HBV感染患者NK、NKT、CTL、HBV特異性CTL細(xì)胞的頻數(shù)與病毒載量的關(guān)系:根據(jù)HBVDNA水平分為兩組，高病毒載量組28例:HBVDNA定量＞10E4IU/ml，低病毒載量組42例，HBVDNA定量＜10E4IU/ML。NK%分別為8.85%±2.95%和21.33%±9.73%(P=0.046);

9、NKT%分別為11.35%±6.52%和22.38%±7.67%(P=0.042);CTL%分別為16.69±0.32和28.15±0.35(p=0.043);HBV特異性CTL%分別為0.85%±0.23%和1.21%±0.185%(P=0.038)。
　　 4.免疫組化顯示:表達(dá)棕黃色顆粒穿孔素細(xì)胞，SACLF患者明顯高于對照組。
　　 5.外周血PBMCPFPmRNA基因表達(dá)水平:慢加急性SACLF組PBMCs中P

10、FPmRNA表達(dá)(0.54±0.78)與CHB患者(0.17±0.20)p=0.035;CHB患者(0.17±0.20)與乙肝病毒攜帶者(0.061±0.05)p=0.041;乙肝攜帶者(0.061±0.05)與健康對照組(0.028±0.018)p=0.031;SACLF患者死亡組(1.13±1.12)與存活組(0.14±0.19)p=0.037;低病毒載量組穿孔素基因表達(dá)量(1.13±0.83)與高病毒載量(0.09±0.82)p=

11、0.046，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 6.穿孔素抗體流式標(biāo)記NK、NKT、CTL、HBV特異性CTL:表達(dá)穿孔素非特異性CTL量在SACLF患者為55.01%±10.56%明顯高于CHB患者25.04%±5.67%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。表達(dá)穿孔素特異性CTL在慢乙肝患者為18.96%±6.98%明顯高于攜帶者4.2%±2.6%，表達(dá)穿孔素NK及NKT在SACLF分別為84.89%±12.4%及57.47%±1.55%明顯高于健康對

12、照組18.54%±16.25%及8.1%±4.53%。
　　 結(jié)論:
　　 1.與健康對照組、乙肝病毒攜帶相比，CHB、SACLF患者外周血NK、NKT細(xì)胞總頻數(shù)顯著降低，但其功能穿孔素表達(dá)量明顯增加，提示在HBV肝臟炎癥時NK、NKT表現(xiàn)為高活性，其活性與肝損害相關(guān)。
　　 2.HBV特異性CTL和非特異性CTL的細(xì)胞頻數(shù)及穿孔素表達(dá)在慢性乙型肝炎患者中明顯增高，與血清ALT正相關(guān)、與HBVDNA負(fù)相關(guān)、與SA