慢性HBV感染者外周血單個核細胞凋亡相關(guān)因子的表達和乙肝慢性化關(guān)系.pdf

1、目的：乙型肝炎病毒(HBV)非常容易造成感染的慢性化，但是其慢性化的發(fā)病機制目前還沒有完全研究清楚。近幾年來的研究成果表明，外周血淋巴細胞的凋亡和免疫耐受的發(fā)生與HBV感染的慢性化有密切的關(guān)系?；罨T導的細胞死亡(AICD)是指已經(jīng)激活的成熟淋巴細胞（T淋巴細胞或B淋巴細胞）在抗原呈遞細胞和細胞因子如IL-1、IL-2的輔助作用下被抗原性物質(zhì)或其他因素活化后，當再一次受到激活信號（尤其是T細胞受體/CD3復合物等）刺激后分泌TNF等細胞

2、因子或通過表達FasL等膜蛋白從而誘導自身所發(fā)生的細胞凋亡。外周血淋巴細胞通過激活誘導的細胞死亡，不僅可以維持機體的免疫穩(wěn)態(tài)，也可能是導致機體外周免疫耐受形成的重要因素。外周血單個核細胞(PBMC)即外周血中具有單個細胞核的細胞，主要由大量的淋巴細胞組成，除此之外還包括少量的自然殺傷細胞(NK)、單核巨噬細胞等各種免疫活性細胞，在機體對抗外來抗原的免疫反應尤其是特異性的細胞免疫反應中起重要作用。
　　細胞凋亡是機體為了維持內(nèi)環(huán)境的

3、穩(wěn)態(tài)，在各種細胞因子的共同參與和凋亡相關(guān)基因的嚴格調(diào)控下，發(fā)生的一系列有步驟的裂解過程，是一種生理性的細胞死亡。細胞的凋亡路徑和信號轉(zhuǎn)導通路的確切發(fā)生機制到目前為止還沒有完全搞清楚。根據(jù)起始激活的Caspase家族成員不同，細胞凋亡的激活途徑可以分為三種:第一種是死亡受體途徑，又稱為外源性途徑，通過FAS配體(FASLG)與FAS(CD95)的結(jié)合而觸發(fā)凋亡。FAS-FASL結(jié)合以后，通過一系列的信號轉(zhuǎn)導反應，導致凋亡蛋白酶8(CASP

4、8)的激活，隨后活化的凋亡蛋白酶8又可以進一步激活凋亡效應器即凋亡蛋白酶3，凋亡蛋白酶6，凋亡蛋白酶7(CASP3，CASP6，CASP7)，由凋亡效應器執(zhí)行下面的凋亡過程。第二種是線粒體途徑，又稱為內(nèi)源性途徑，在凋亡信號的刺激下，原本儲存在線粒體膜間隙的凋亡誘導因子(AIF)、細胞色素C(CytC)等釋放出來到胞漿中誘導細胞凋亡。在ATP/dATP存在的前提條件下，位于膜間隙中的大量CytC釋放處理進入到胞漿，然后與Apaf-1形成多

5、聚復合體，通過Apaf-1 N-末端的Caspase-募集結(jié)構(gòu)域(CARD)招募聚集胞質(zhì)中的caspase-9，并誘導其活化進而導致細胞凋亡。第三種是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑，在應激狀態(tài)下促使caspase-7由胞漿轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面，同時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)誘導caspase-12的表達增加。由Caspase-7進一步激活caspase-12，而后者激活后又可進一步剪切加工caspase3，進而誘導細胞凋亡發(fā)生。
　　本次研究的目的在于探討慢性HBV感染者P

6、BMC中是否存在AICD現(xiàn)象，外周血淋巴細胞不同的凋亡路徑，及其在HBV感染慢性化過程中作用。
　　方法：1.入選標準和排除標準:慢性HBV攜帶者9名，慢性乙型肝炎患者48名（其中輕度患者14例，中度患者22例，重度患者12例），肝硬化患者24名，所有入選患者的診斷符合2010年《慢性乙型肝炎防治指南》的診斷標準，并排除甲、丙、丁和戊型肝炎及其他原因所致的肝損害。20例健康人為正常對照組。
　　2.標本采集:嚴格按照無菌操作

7、的原則，采集空腹靜脈血7ml，加入EDTA抗凝。其中3ml離心(2000r/min，5min)獲得血漿，-80℃保存?zhèn)溆谩?ml新鮮全血用Ficoll密度梯度離心法提取PBMC，-80℃保存?zhèn)溆谩?br>　　3.提取總RNA,測定RNA濃度和純度取出凍存的PBMC，室溫條件下解凍5min，然后加入1ml Trizol，嚴格按照試劑盒說明書規(guī)范操作，提取總RNA，測定RNA濃度和純度，保證A260/A280在1.8～2.0。
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8、.實時熒光定量PCR檢測PBMC中FAS，CASP-8，CYCS，CASP-9，CASP-3的表達。
　　5.采用“雙抗體一步夾心法”酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血漿中CASP-8，CASP-9，CASP-3的表達。
　　結(jié)果：1.實時熒光定量PCR結(jié)果顯示:CHB組和ASC組凋亡相關(guān)基因（FAS，Caspase-8，CYCS，Caspase-9，Caspase-3）的表達明顯高于NC組和LC組，差異具有統(tǒng)計學意義(P

9、＜0.05)，LC組高于NC組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而CHB組和ASC組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　2.ELISA結(jié)果顯示:血漿Caspase-9，Caspase-8，Caspase-3濃度由高到低依次為CHB組和ASC組＞LC組＞NC組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.0083)，CHB組和ASC組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.0083)。
　　3.ELISA結(jié)果顯示:HBV-DNA陽性組血漿Caspase

10、-9，Caspase-8，Caspase-3的濃度均明顯高于HBV-DNA陰性組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　4.ELISA結(jié)果顯示:血漿Caspase-9，Caspase-8，Caspase-3濃度水平由高到低依次為:慢性乙肝（輕度）組＞慢性乙肝（中度）組＞慢性乙肝（重度）組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　結(jié)論：HBV感染可以誘導外周血單個核細胞的凋亡(即AICD)，內(nèi)源性路徑（即線粒體途徑）和外源