慢性乙型肝炎病毒感染者外周血單個核細(xì)胞中微小RNA的表達(dá)分析及其功能研究.pdf

1、背景：乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染所致的慢加急性肝衰竭(HBV-related acute-on-chronic liver failure，ACLF)是臨床常見的危重癥，病死率較高，對人類危害嚴(yán)重。關(guān)于ACLF的發(fā)病機(jī)制，目前認(rèn)為主要包括病毒復(fù)制和宿主免疫反應(yīng)及其相互作用兩個方面，但是HBV無直接致細(xì)胞病變效應(yīng)，其本身并不直接對感染細(xì)胞產(chǎn)生破壞效應(yīng)，由此人們認(rèn)為ACLF發(fā)病機(jī)制的主要環(huán)節(jié)為病毒在一定條

2、件下所誘發(fā)的宿主免疫應(yīng)答異常。微小RNA(microRNA，miRNA)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類非編碼小分子RNA。miRNA表達(dá)豐富，作用廣泛，胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖分化均受miRNA的調(diào)控，同時miRNA也參與機(jī)體免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)。miRNA可以通過Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）與細(xì)胞因子信號途徑對機(jī)體固有免疫進(jìn)行調(diào)控，也可通過干擾抗原呈遞及T細(xì)胞受體(T cell receptors，TCRs)途徑對機(jī)體

3、適應(yīng)性免疫進(jìn)行調(diào)控。作為機(jī)體免疫應(yīng)答的始動者，miRNA在HBV感染發(fā)病機(jī)制中的作用也日益得到重視。多項研究已經(jīng)證實，多個miRNA參與控制HBV復(fù)制、HBV相關(guān)肝臟疾病的進(jìn)展，尤其是肝硬化和肝細(xì)胞癌的進(jìn)展;也有研究發(fā)現(xiàn)對于接受干擾素(interferon，IFN)治療的慢性HBV或丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染者，可利用患者外周血單個核細(xì)胞(Peripheral bloodmononuclear cel

4、ls，PBMC)中miRNA表達(dá)水平的變化來協(xié)助判斷疾病的臨床轉(zhuǎn)歸。然而關(guān)于miRNA與ACLF的關(guān)系，目前知之甚少。
　　目的：⑴了解肝臟炎癥程度不同的慢性HBV感染者PBMC中miRNA的表達(dá)譜。⑵確認(rèn)慢性HBV感染者PBMC中是否存在與肝臟炎癥程度相關(guān)的特異性miRNA。⑶對特異性miRNA可能的靶基因進(jìn)行預(yù)測，了解慢性HBV感染者PBMC中特異性miRNA靶基因的表達(dá)水平。⑷對miR-197、miR-328的靶基因進(jìn)行確認(rèn)

5、，初步探討慢性HBV感染者體內(nèi)miR-197、miR-328的作用途徑。
　　方法：①應(yīng)用miRNA基因芯片技術(shù)對HBV相關(guān)的4例無癥狀攜帶者（asymptomatic carrier，ASC）及4例ACLF患者PBMC中miRNA的表達(dá)譜進(jìn)行檢測，對差異性表達(dá)的miRNA進(jìn)行篩選。②采用TargetScan5.2，DIANA-microT3.0及Pictar生物軟件對miR-197、miR-328的靶基因進(jìn)行預(yù)測。③采用實時熒光

6、定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time polymerase chain reaction，real-time PCR)對HBV相關(guān)的70例ASC，107例慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者，76例ACLF患者，及51例健康對照者PBMC中miR-150、miR-197、miR-223、miR-328、miR-30a、miR-574-3p的表達(dá)水平進(jìn)行驗證分析;同時對PBMC中miR-197的靶基因白細(xì)胞

7、介素18(interleukin18，IL18)、腫瘤壞死因子配體超家族10(tumor necrosis factor ligandsuperfamily member10，TNFSF10)，miR-328的靶基因腫瘤壞死因子受體超家族9(tumor necrosis factor receptor superfamily member9，TNFRSF9)的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測。④采用基因瞬時轉(zhuǎn)染的方法，分別將miR-197 mi

8、mic和inhibitor; miR-328 mimic和inhibitor轉(zhuǎn)染至單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞中，采用CCK-8法檢測各轉(zhuǎn)染組及對照組細(xì)胞增殖率;酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA)檢測各轉(zhuǎn)染組及對照組細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL18表達(dá)水平;應(yīng)用real-time PCR檢測各轉(zhuǎn)染組及對照組miR-328，miR-197與TNFRSF9、TNFSF10、IL18的mRNA表

9、達(dá)水平;western blot檢測各轉(zhuǎn)染組及對照組TNFRSF9、TNFSF10的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：⑴miRNA基因芯片檢測顯示慢性HBV感染所致的ASC與ACLF患者PBMC中共有17個miRNAs出現(xiàn)差異性表達(dá)，與ASC患者相比較，肝臟炎癥活動明顯的ACLF患者PBMC中hsa-miR-1246、hsa-miR-30a、hsa-miR-1305、hsa-miR-193a-3p和hsa-miR-196b共5個miRNA

10、s表達(dá)上調(diào)，同時hsa-miR-223、hsa-miR-574-3p、hsa-miR-150等12個miRNAs表達(dá)下調(diào)。⑵對肝臟炎癥程度不同的慢性HBV感染者PBMC中miRNA的表達(dá)水平擴(kuò)大樣本進(jìn)行驗證分析發(fā)現(xiàn)，miR-197、miR-574-3p及miR-30a的PCR驗證分析結(jié)果與miRNA基因芯片分析結(jié)果一致，而miR-150、miR-223與miR-328的PCR驗證分析結(jié)果與miRNA基因芯片分析結(jié)果存在一定的差異。驗證分

11、析顯示隨著慢性HBV感染者肝臟炎癥程度的逐漸加重，miR-197的表達(dá)水平逐漸下調(diào)，而miR-328的表達(dá)水平逐漸上調(diào)。同時，正常對照組PBMC中miR-574-3p、miR-30a的表達(dá)水平較慢性HBV感染者明顯升高;而與正常對照組相比較，ACLF患者PBMC中miR-150表達(dá)上調(diào);但是各組間miR-223的表達(dá)水平無明顯差異。⑶TargetScan5.2等靶基因預(yù)測軟件分析發(fā)現(xiàn)，miR-197可與TNFRSF9、TNFSF10、I

12、L18的3'非編碼區(qū)(untranslated region，UTR)互補(bǔ)配對，miR-328可與TNFRSF9的3'UTR互補(bǔ)配對。肝臟炎癥程度不同的慢性HBV感染者PBMC中，TNFRSF9的表達(dá)水平隨肝臟炎癥程度的加重而降低，與miR-328的表達(dá)水平趨勢相反;TNFSF10、IL18的表達(dá)水平隨肝臟炎癥程度的加重而增加，與miR-197的表達(dá)水平趨勢相反。⑷與空白轉(zhuǎn)染組及mimic control(miR-C)轉(zhuǎn)染組，inhib

13、itor control(anti-miR-C)轉(zhuǎn)染組相比較，miR-197 mimic轉(zhuǎn)染組中IL18、TNFRSF9、TNFSF10的mRNA及蛋白表達(dá)水平均降低，有顯著性差異;miR-197 inhibitor轉(zhuǎn)染組中IL18的mRNA及蛋白表達(dá)水平均增加，有顯著性差異;雖然miR-197 inhibitor轉(zhuǎn)染組中TNFRSF9的mRNA表達(dá)水平明顯增加，但是其蛋白表達(dá)水平并沒有顯著增加;同時，miR-197 inhibitor

14、轉(zhuǎn)染組中TNFSF10的mRNA表達(dá)水平明顯增加，但是其蛋白表達(dá)水平并沒有顯著增加;與空白轉(zhuǎn)染組及miR-C轉(zhuǎn)染組，anti-miR-C轉(zhuǎn)染組相比較，miR-328 mimic轉(zhuǎn)染組中TNFRSF9的mRNA及蛋白表達(dá)水平均降低，有顯著性差異;miR-328 inhibitor轉(zhuǎn)染組中TNFRSF9的mRNA及蛋白表達(dá)水平均增加，有顯著性差異。
　　結(jié)論：①miRNA基因芯片檢測技術(shù)的重復(fù)性欠佳，miRNA表達(dá)譜的確定需結(jié)合rea

15、l-time PCR檢測技術(shù)綜合分析。②慢性HBV感染者PBMC中存在與肝臟炎癥程度相關(guān)的特異性miRNA，這些miRNA（尤其是miR-197，miR-328）參與HBV的發(fā)病，可能是慢性HBV相關(guān)肝臟炎癥程度的潛在生物學(xué)標(biāo)志之一。③慢性HBV感染者PBMC中IL18、TNFRSF9、TNFSF10的表達(dá)水平與肝臟炎癥程度存在一定的聯(lián)系。④miR-197可對IL18的mRNA及蛋白表達(dá)水平產(chǎn)生負(fù)性調(diào)節(jié)作用;miR-328可對TNFRS