HBV慢性感染者血清抗-HBx與細(xì)胞因子相關(guān)性研究.pdf

1、研究背景及目的：據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球約20億人感染過(guò)乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)，其中有3.5億人為HBV慢性感染者，每年約有100萬(wàn)人死于HBV慢性感染所致的肝衰竭、肝炎后肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌[1]。世界不同地區(qū)HBV感染的流行強(qiáng)度差異很大，我國(guó)已經(jīng)從高流行區(qū)降低為中度流行區(qū)。2006年全國(guó)流行病學(xué)調(diào)查表明，我國(guó)1～59歲一般人群居民的乙肝表面抗原陽(yáng)性率約7.18％[2]，5歲以下兒童的乙肝表面抗原

2、陽(yáng)性率僅為1％[3-4]。據(jù)此推算，我國(guó)現(xiàn)有的慢性HBV感染者約9300萬(wàn)，其中慢性乙型肝炎患者約2000萬(wàn)例[5]。HBV慢性感染嚴(yán)重威脅著我國(guó)人民的健康。
　　 HBV感染后，機(jī)體大部分呈現(xiàn)出亞臨床感染過(guò)程，一部分表現(xiàn)為急性病毒性肝炎，病毒很快被清除，極小部分發(fā)展成重肝，另有小部分轉(zhuǎn)變?yōu)槁愿窝祝磸?fù)發(fā)病，持續(xù)多年，其中有些最終形成肝炎后肝硬化或原發(fā)性肝細(xì)胞癌。造成HBV慢性感染者疾病不同轉(zhuǎn)歸的機(jī)制尚不明確。研究表明，乙肝病

3、毒x蛋白(HBx)是HBV基因組所編碼蛋白質(zhì)中唯一具有多種調(diào)控功能的病毒蛋白質(zhì)，這些調(diào)控作用決定了HBV X基因及表達(dá)產(chǎn)物HBx在HBV感染免疫機(jī)制中的復(fù)雜功能。HBx具有復(fù)雜的生物學(xué)活性，對(duì)多種基因具有反式激活作用，與病毒基因整合和宿主細(xì)胞的基因突變密切相關(guān)[6]。HBx可通過(guò)多種調(diào)控作用直接或者間接地對(duì)病毒的復(fù)制與增殖以及宿主細(xì)胞的凋亡、癌變等過(guò)程產(chǎn)生廣泛的影響。HBV X基因編碼蛋白HBx包含6個(gè)區(qū)(A～F)，共154個(gè)氨基酸(a

4、mino acid，aa)。HBx調(diào)控功能主要包括：激活宿主細(xì)胞和病毒自身基因的轉(zhuǎn)錄、調(diào)控細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞中受損DNA的外切修復(fù)反應(yīng)、增強(qiáng)原癌基因的轉(zhuǎn)錄活性、激活人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶、激活細(xì)胞中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和促進(jìn)肝纖維化等。HBx通過(guò)多種調(diào)控作用直接或間接地對(duì)病毒自身的復(fù)制、宿主細(xì)胞中基因的表達(dá)、細(xì)胞的凋亡與癌變等過(guò)程產(chǎn)生廣泛的影響。HBx即乙型肝炎病毒X抗原(HBxAg)在肝癌組織細(xì)胞中呈高表達(dá)狀態(tài)。HBxAg反式激活肝細(xì)胞原癌基因異常

5、活化、促使肝細(xì)胞發(fā)生癌變。HBV X基因及其表達(dá)產(chǎn)物HBx成為近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。
　　 雖然大部分HBV在肝細(xì)胞中復(fù)制，但是病毒也會(huì)侵犯宿主免疫系統(tǒng)，激活免疫細(xì)胞，產(chǎn)生炎癥及抗體，HBxAg刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體(HBxAb)即抗-HBx。Park EH等報(bào)道在慢性HBV感染者、肝硬化、肝細(xì)胞癌患者肝臟組織中能夠檢測(cè)到HBxAg[7]。Horiike N等發(fā)現(xiàn)HBxAg在慢性乙型病毒性肝炎患者肝臟組織中普遍存在，與丙氨酸氨基轉(zhuǎn)

6、移酶有明顯的相關(guān)性而與HBV復(fù)制的血清標(biāo)志物沒(méi)有關(guān)聯(lián)[8]。Huang Y等研究發(fā)現(xiàn)，在慢性活動(dòng)性肝炎患者血清中，HBxAg量與HBeAg的含量相似；在血清HBeAg、HBVDNA且肝組織HBcAg陽(yáng)性的患者中，HBxAg的陽(yáng)性率較高[9]。檢測(cè)HBV X基因的表達(dá)也許會(huì)有利于對(duì)慢性乙型病毒性肝炎及其導(dǎo)致的肝硬化和肝癌的早期診斷和預(yù)后判斷[10]。而機(jī)體針對(duì)HBxAg產(chǎn)生的抗體(抗-HBx)有學(xué)者認(rèn)為是一個(gè)普遍的、乙型病毒性肝炎感染的早

7、期標(biāo)志物，在急性乙型病毒性肝炎中短暫的出現(xiàn)，在慢性乙型病毒性肝炎中持續(xù)的存在，抗-HBx的量與乙型肝炎病毒復(fù)制的持續(xù)性和強(qiáng)度有關(guān)聯(lián)，而與肝臟疾病的嚴(yán)重性及惡性進(jìn)展沒(méi)有關(guān)聯(lián)[11]。Moriarty等發(fā)現(xiàn)抗-HBx與HBV相關(guān)性肝細(xì)胞癌密切相關(guān)，可以作為肝細(xì)胞癌癌前標(biāo)志物。血清中抗-HBx是HBV復(fù)制的標(biāo)志，尤其是由乙型肝炎病毒導(dǎo)致的肝炎后肝硬化及原發(fā)性肝細(xì)胞癌的標(biāo)志物，而不是一種保護(hù)性抗體[12]。有學(xué)者應(yīng)用鼠抗-HBxAg的單克隆作為

8、載體攜帶碘131靶向治療2例肝細(xì)胞肝癌患者，2例患者的AFP顯著降低，癥狀得到明顯改善[13]。Kim JW等認(rèn)為，在乙型肝炎病毒感染的慢性過(guò)程中，HBxAg/抗-HBx的存在與標(biāo)志病毒持續(xù)復(fù)制的血清學(xué)標(biāo)志有關(guān)聯(lián)。
　　 近幾年，關(guān)于乙肝病毒X基因與肝細(xì)胞癌關(guān)系的研究較多，慢性HBV感染過(guò)程中宿主的免疫狀態(tài)及各種細(xì)胞因子的檢測(cè)亦是人們研究的熱點(diǎn)。但是，乙肝病毒X基因表達(dá)產(chǎn)物HBxAg刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗-HBx的意義、及其與宿主各種

9、細(xì)胞因子的關(guān)系怎樣尚未見(jiàn)詳細(xì)研究報(bào)道。本文擬通過(guò)對(duì)HBV慢性感染者免疫耐受期(即無(wú)癥狀攜帶者，ASC)、免疫清除期(即慢性乙型肝炎，CHB)、乙肝肝硬化(LC)和乙肝相關(guān)性肝細(xì)胞癌(HCC)共90例患者血清中抗-HBx、Fas(可溶性Fas，sFas)、IL-10、IL-12等的檢測(cè)和比較，探討抗-HBx出現(xiàn)的意義和與其他免疫指標(biāo)的相互關(guān)系。闡明抗-HBx變化與HBV慢性感染預(yù)后的關(guān)系，豐富乙型肝炎致病理論，為尋找抗HBV治療新的靶點(diǎn)、

10、時(shí)機(jī)和策略提供依據(jù)。
　　 方法：隨機(jī)選擇90例山東籍HBV慢性感染者，即無(wú)癥狀攜帶者10例、慢性乙型肝炎28例、乙肝肝硬化26例和乙肝相關(guān)性肝細(xì)胞癌26例。所有患者均空腹抽血，制備血清。應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、膽紅素(TBL)等肝功能指標(biāo)，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法測(cè)定IL-10、IL-12和Fas，采用我們建立的ELISA方法檢測(cè)患者血清中抗-HBx。
　　 結(jié)果：
　　 1.從無(wú)

11、癥狀慢性：HBV攜帶者到慢性乙型肝炎(慢乙肝)、乙肝肝硬化和乙肝相關(guān)性肝細(xì)胞癌患者外周血IL-10、IL-12和Fas水平均呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢(shì)。4組患者檢測(cè)的結(jié)果IL-10分別是13.93±14.40ng/L，39.38±20.77ng/L，69.06±46.37ng/L和62.82±23.42ng/L；IL-12分別是15.64±23.04ng/L，68.50±23.14ng/L，76.83±12.82ng/L和83.74±24.88

12、ng/L；Fas分別是58.17±77.42ng/L，179.88±104.36ng/L，249.22±107.80ng/L和252.98±87.65ng/L。以上3項(xiàng)指標(biāo)在無(wú)癥狀攜帶者與其他3組之間均有顯著性差異(P<0.001)；肝硬化和肝癌組也分別高于慢乙肝組，其中IL-10、Fas水平差異顯著(P<0.05)，IL-12水平在慢乙肝組與肝硬化組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.154)，慢乙肝組與肝癌組差異顯著(P=0.01)。肝硬化組和

13、肝癌組相比，IL-12、Fas以肝癌組略高，lL-10以肝硬化組稍高，但差異無(wú)顯著性(P>0.05)。
　　 2.90例病人中抗-HBx陽(yáng)性27例，其中攜帶者(ASC)1例，慢乙肝(CHB)4例、肝硬化(LC)12例、肝細(xì)胞癌患者(HCC)10例，其陽(yáng)性比例分別為10％、14.28％、46.15％和38.46％。
　　 3.根據(jù)抗-HBx定性結(jié)果將病人分為抗-HBx陰性和抗HBx陽(yáng)性2組。抗-HBx陽(yáng)性組病人其IL-10

14、、IL-12、Fas三項(xiàng)細(xì)胞因子水平均高于陰性組，其中陰性組測(cè)得以上三項(xiàng)結(jié)果分別為194.21±111.64 ng/L，45.98±29.54 ng/L，64.81±27.57 ng/L，陽(yáng)性組病人結(jié)果分別為238.25±118.33 ng/L，65.73±43.42 ng/L，80.23±29.69 ng/L，IL-10、IL-12在2組間差異顯著(P均<0.05)，F(xiàn)as結(jié)果在2組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.094)。
　　 結(jié)

15、論：
　　 1.從HBV慢性攜帶者到慢乙肝、乙肝肝硬化和乙肝相關(guān)性肝細(xì)胞癌患者的外周血IL-10、IL-12水平均呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢(shì)，但以IL-10增高明顯，IL-12分泌相對(duì)不足，提示IL-10水平升高與疾病進(jìn)展密切相關(guān)。
　　 2.血清Fas水平在肝硬化、肝癌的發(fā)展過(guò)程中可能起著非常重要的作用，血清Fas的測(cè)定可以作為慢性乙型肝炎患者肝組織損傷程度的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。
　　 3.血清中抗-HBx并非保護(hù)性抗體，抗