HBV慢性感染者血清抗-HBx與細胞因子相關(guān)性研究.pdf

1、研究背景及目的：據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球約20億人感染過乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)，其中有3.5億人為HBV慢性感染者，每年約有100萬人死于HBV慢性感染所致的肝衰竭、肝炎后肝硬化和原發(fā)性肝細胞癌[1]。世界不同地區(qū)HBV感染的流行強度差異很大，我國已經(jīng)從高流行區(qū)降低為中度流行區(qū)。2006年全國流行病學調(diào)查表明，我國1～59歲一般人群居民的乙肝表面抗原陽性率約7.18％[2]，5歲以下兒童的乙肝表面抗原

2、陽性率僅為1％[3-4]。據(jù)此推算，我國現(xiàn)有的慢性HBV感染者約9300萬，其中慢性乙型肝炎患者約2000萬例[5]。HBV慢性感染嚴重威脅著我國人民的健康。
　　 HBV感染后，機體大部分呈現(xiàn)出亞臨床感染過程，一部分表現(xiàn)為急性病毒性肝炎，病毒很快被清除，極小部分發(fā)展成重肝，另有小部分轉(zhuǎn)變?yōu)槁愿窝?，反復發(fā)病，持續(xù)多年，其中有些最終形成肝炎后肝硬化或原發(fā)性肝細胞癌。造成HBV慢性感染者疾病不同轉(zhuǎn)歸的機制尚不明確。研究表明，乙肝病

3、毒x蛋白(HBx)是HBV基因組所編碼蛋白質(zhì)中唯一具有多種調(diào)控功能的病毒蛋白質(zhì)，這些調(diào)控作用決定了HBV X基因及表達產(chǎn)物HBx在HBV感染免疫機制中的復雜功能。HBx具有復雜的生物學活性，對多種基因具有反式激活作用，與病毒基因整合和宿主細胞的基因突變密切相關(guān)[6]。HBx可通過多種調(diào)控作用直接或者間接地對病毒的復制與增殖以及宿主細胞的凋亡、癌變等過程產(chǎn)生廣泛的影響。HBV X基因編碼蛋白HBx包含6個區(qū)(A～F)，共154個氨基酸(a

4、mino acid，aa)。HBx調(diào)控功能主要包括：激活宿主細胞和病毒自身基因的轉(zhuǎn)錄、調(diào)控細胞凋亡、抑制細胞中受損DNA的外切修復反應、增強原癌基因的轉(zhuǎn)錄活性、激活人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶、激活細胞中信號轉(zhuǎn)導通路和促進肝纖維化等。HBx通過多種調(diào)控作用直接或間接地對病毒自身的復制、宿主細胞中基因的表達、細胞的凋亡與癌變等過程產(chǎn)生廣泛的影響。HBx即乙型肝炎病毒X抗原(HBxAg)在肝癌組織細胞中呈高表達狀態(tài)。HBxAg反式激活肝細胞原癌基因異常

5、活化、促使肝細胞發(fā)生癌變。HBV X基因及其表達產(chǎn)物HBx成為近年來國內(nèi)外的研究熱點。
　　 雖然大部分HBV在肝細胞中復制，但是病毒也會侵犯宿主免疫系統(tǒng)，激活免疫細胞，產(chǎn)生炎癥及抗體，HBxAg刺激機體產(chǎn)生的抗體(HBxAb)即抗-HBx。Park EH等報道在慢性HBV感染者、肝硬化、肝細胞癌患者肝臟組織中能夠檢測到HBxAg[7]。Horiike N等發(fā)現(xiàn)HBxAg在慢性乙型病毒性肝炎患者肝臟組織中普遍存在，與丙氨酸氨基轉(zhuǎn)

6、移酶有明顯的相關(guān)性而與HBV復制的血清標志物沒有關(guān)聯(lián)[8]。Huang Y等研究發(fā)現(xiàn)，在慢性活動性肝炎患者血清中，HBxAg量與HBeAg的含量相似；在血清HBeAg、HBVDNA且肝組織HBcAg陽性的患者中，HBxAg的陽性率較高[9]。檢測HBV X基因的表達也許會有利于對慢性乙型病毒性肝炎及其導致的肝硬化和肝癌的早期診斷和預后判斷[10]。而機體針對HBxAg產(chǎn)生的抗體(抗-HBx)有學者認為是一個普遍的、乙型病毒性肝炎感染的早

7、期標志物，在急性乙型病毒性肝炎中短暫的出現(xiàn)，在慢性乙型病毒性肝炎中持續(xù)的存在，抗-HBx的量與乙型肝炎病毒復制的持續(xù)性和強度有關(guān)聯(lián)，而與肝臟疾病的嚴重性及惡性進展沒有關(guān)聯(lián)[11]。Moriarty等發(fā)現(xiàn)抗-HBx與HBV相關(guān)性肝細胞癌密切相關(guān)，可以作為肝細胞癌癌前標志物。血清中抗-HBx是HBV復制的標志，尤其是由乙型肝炎病毒導致的肝炎后肝硬化及原發(fā)性肝細胞癌的標志物，而不是一種保護性抗體[12]。有學者應用鼠抗-HBxAg的單克隆作為

8、載體攜帶碘131靶向治療2例肝細胞肝癌患者，2例患者的AFP顯著降低，癥狀得到明顯改善[13]。Kim JW等認為，在乙型肝炎病毒感染的慢性過程中，HBxAg/抗-HBx的存在與標志病毒持續(xù)復制的血清學標志有關(guān)聯(lián)。
　　 近幾年，關(guān)于乙肝病毒X基因與肝細胞癌關(guān)系的研究較多，慢性HBV感染過程中宿主的免疫狀態(tài)及各種細胞因子的檢測亦是人們研究的熱點。但是，乙肝病毒X基因表達產(chǎn)物HBxAg刺激機體產(chǎn)生的抗-HBx的意義、及其與宿主各種

9、細胞因子的關(guān)系怎樣尚未見詳細研究報道。本文擬通過對HBV慢性感染者免疫耐受期(即無癥狀攜帶者，ASC)、免疫清除期(即慢性乙型肝炎，CHB)、乙肝肝硬化(LC)和乙肝相關(guān)性肝細胞癌(HCC)共90例患者血清中抗-HBx、Fas(可溶性Fas，sFas)、IL-10、IL-12等的檢測和比較，探討抗-HBx出現(xiàn)的意義和與其他免疫指標的相互關(guān)系。闡明抗-HBx變化與HBV慢性感染預后的關(guān)系，豐富乙型肝炎致病理論，為尋找抗HBV治療新的靶點、

10、時機和策略提供依據(jù)。
　　 方法：隨機選擇90例山東籍HBV慢性感染者，即無癥狀攜帶者10例、慢性乙型肝炎28例、乙肝肝硬化26例和乙肝相關(guān)性肝細胞癌26例。所有患者均空腹抽血，制備血清。應用全自動生化分析儀測定谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、膽紅素(TBL)等肝功能指標，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗法測定IL-10、IL-12和Fas，采用我們建立的ELISA方法檢測患者血清中抗-HBx。
　　 結(jié)果：
　　 1.從無

11、癥狀慢性：HBV攜帶者到慢性乙型肝炎(慢乙肝)、乙肝肝硬化和乙肝相關(guān)性肝細胞癌患者外周血IL-10、IL-12和Fas水平均呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢。4組患者檢測的結(jié)果IL-10分別是13.93±14.40ng/L，39.38±20.77ng/L，69.06±46.37ng/L和62.82±23.42ng/L；IL-12分別是15.64±23.04ng/L，68.50±23.14ng/L，76.83±12.82ng/L和83.74±24.88

12、ng/L；Fas分別是58.17±77.42ng/L，179.88±104.36ng/L，249.22±107.80ng/L和252.98±87.65ng/L。以上3項指標在無癥狀攜帶者與其他3組之間均有顯著性差異(P<0.001)；肝硬化和肝癌組也分別高于慢乙肝組，其中IL-10、Fas水平差異顯著(P<0.05)，IL-12水平在慢乙肝組與肝硬化組間無統(tǒng)計學意義(P=0.154)，慢乙肝組與肝癌組差異顯著(P=0.01)。肝硬化組和

13、肝癌組相比，IL-12、Fas以肝癌組略高，lL-10以肝硬化組稍高，但差異無顯著性(P>0.05)。
　　 2.90例病人中抗-HBx陽性27例，其中攜帶者(ASC)1例，慢乙肝(CHB)4例、肝硬化(LC)12例、肝細胞癌患者(HCC)10例，其陽性比例分別為10％、14.28％、46.15％和38.46％。
　　 3.根據(jù)抗-HBx定性結(jié)果將病人分為抗-HBx陰性和抗HBx陽性2組?？?HBx陽性組病人其IL-10

14、、IL-12、Fas三項細胞因子水平均高于陰性組，其中陰性組測得以上三項結(jié)果分別為194.21±111.64 ng/L，45.98±29.54 ng/L，64.81±27.57 ng/L，陽性組病人結(jié)果分別為238.25±118.33 ng/L，65.73±43.42 ng/L，80.23±29.69 ng/L，IL-10、IL-12在2組間差異顯著(P均<0.05)，F(xiàn)as結(jié)果在2組間無統(tǒng)計學意義(P=0.094)。
　　 結(jié)

15、論：
　　 1.從HBV慢性攜帶者到慢乙肝、乙肝肝硬化和乙肝相關(guān)性肝細胞癌患者的外周血IL-10、IL-12水平均呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢，但以IL-10增高明顯，IL-12分泌相對不足，提示IL-10水平升高與疾病進展密切相關(guān)。
　　 2.血清Fas水平在肝硬化、肝癌的發(fā)展過程中可能起著非常重要的作用，血清Fas的測定可以作為慢性乙型肝炎患者肝組織損傷程度的評價指標之一。
　　 3.血清中抗-HBx并非保護性抗體，抗