NK、NKT細(xì)胞特異性表達(dá)Cre重組酶knock-in小鼠的建立.pdf

1、基因打靶技術(shù)包括基因敲入(Gene knock-in)與基因敲除(Gene knock-out)，是通過(guò)同源重組將外源基因定點(diǎn)整合入ES細(xì)胞基因組上某一確定的位點(diǎn)，以達(dá)到定點(diǎn)修飾改造染色體上某一基因?yàn)槟康牡囊豁?xiàng)技術(shù)。構(gòu)建打靶載體是該技術(shù)運(yùn)用中的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
　　Cre-loxP系統(tǒng)的條件基因敲除技術(shù)，是在細(xì)胞或組織特異性的Cre重組酶knock-in或轉(zhuǎn)基因小鼠的作用下，實(shí)現(xiàn)在特定細(xì)胞及特定發(fā)育階段敲除目的基因并研究其功能的一項(xiàng)

2、重要的實(shí)驗(yàn)手段。采用Cre-loxP重組系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)組織特異性基因敲除可以克服傳統(tǒng)的完全基因敲除技術(shù)的這一缺陷，能有效地避免完全敲除導(dǎo)致的胚胎致死。在這個(gè)系統(tǒng)中，細(xì)胞或組織特異性的Cre重組酶knock-in或轉(zhuǎn)基因小鼠的研制是至關(guān)重要的一環(huán)。
　　到目前為止，已有多種在不同免疫細(xì)胞中特異性表達(dá)的Cre重組酶knock-in或轉(zhuǎn)基因小鼠，如:B細(xì)胞；T細(xì)胞；樹(shù)突細(xì)胞；巨噬細(xì)胞；嗜中性粒細(xì)胞等均有特異性表達(dá)的Cre重組酶knock-in

3、或轉(zhuǎn)基因小鼠。但在NK、NKT細(xì)胞特異性表達(dá)的Cre重組酶knock-in或轉(zhuǎn)基因小鼠尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　制備細(xì)胞或組織特異性的Cre重組酶knock-in或轉(zhuǎn)基因小鼠，最常用的方法是用細(xì)胞或組織特異性表達(dá)基因的啟動(dòng)子來(lái)調(diào)控Cre重組酶的表達(dá)。NK1.1是目前已知的在小鼠的NK、NKT細(xì)胞特異性的標(biāo)志分子，是NK細(xì)胞NKR-P1家族中的一個(gè)成員NKR-P1C，在小鼠CD分組中編號(hào)為CD161。此外，129/Ola和C57BL/6J品

4、系小鼠都表達(dá)NK1.1分子，只是129/Ola品系小鼠表達(dá)的NK1.1分子與C57BL/6J品系小鼠表達(dá)的NK1.1分子相比，有一個(gè)氨基酸突變(191位的丙氨酸Ala變成了蘇氨酸Thr)而不能被NK1.1分子的抗體識(shí)別。因此NK1.1啟動(dòng)子十分適合作為本研究的組織特異性啟動(dòng)子以介導(dǎo) Cre重組酶在NK、NKT細(xì)胞中的表達(dá)。
　　本文利用Recombineering技術(shù)成功構(gòu)建了將Cre基因定點(diǎn)敲入到小鼠NK1.1基因啟動(dòng)子下的Cr

5、e knock-in基因打靶載體。后續(xù)用此載體轉(zhuǎn)染小鼠胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cells，ES cells)，然后通過(guò)PCR的方法鑒定出打靶正確的ES細(xì)胞，再將其顯微注射到C57BL/6J品系與DBA2品系的F2代子代的囊胚(Blastocyst)(E3.5天)，并將10-20個(gè)囊胚植入假孕雌鼠子宮，獲得嵌合體小鼠。將得到的嵌合率較高的雄性嵌合體小鼠與 C57BL/6J雌性小鼠交配，觀察F1代小鼠的毛色。通過(guò)PCR鑒定

6、F1代棕色小鼠基因型，進(jìn)而確定構(gòu)建的NK1.1-Cre knock-in小鼠模型。
　　本文首次構(gòu)建了NK、NKT細(xì)胞特異性表達(dá)Cre重組酶knock-in小鼠，該小鼠的成功建立，可廣泛應(yīng)用于在NK、NKT細(xì)胞中進(jìn)行組織特異性基因打靶研究，為利用條件基因打靶技術(shù)深入研究特定基因在NK、NKT細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中，以及在相關(guān)疾病中的作用和機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。因此預(yù)測(cè)，未來(lái)幾年將會(huì)有更多的在不同免疫細(xì)胞中特異性表達(dá)的Cre重組酶knock