線蟲(chóng)神經(jīng)元特異性表達(dá)體系的建立與應(yīng)用.pdf

1、線蟲(chóng)作為一種重要的模式生物,具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,生命周期短,繁殖能力強(qiáng)等特點(diǎn)而被用于神經(jīng)生物學(xué)研究。其神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,可分為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、感覺(jué)神經(jīng)元、中間神經(jīng)元等幾大類。線蟲(chóng)神經(jīng)功能研究中,通常進(jìn)行特異性表達(dá)或標(biāo)記神經(jīng)元以進(jìn)行針對(duì)性的研究。然而,線蟲(chóng)中能被特異性標(biāo)記的神經(jīng)元和標(biāo)記方法都較少,且需要繁復(fù)的人力勞動(dòng)進(jìn)行載體構(gòu)建。本研究以解決這些問(wèn)題為基本出發(fā)點(diǎn)。
　　本研究將線蟲(chóng)單神經(jīng)元表達(dá)的啟動(dòng)子構(gòu)建成MultisiteGateway體系

2、的第一個(gè)入門(mén)克隆形式,以便于高效準(zhǔn)確的進(jìn)行表達(dá)克隆構(gòu)建。在進(jìn)行大片段DNA序列的BP反應(yīng)時(shí),效率不高,但經(jīng)濟(jì)成本高昂。為解決這個(gè)問(wèn)題,引進(jìn)In-fusion技術(shù),將神經(jīng)元特異性表達(dá)的啟動(dòng)子構(gòu)建形成入門(mén)克隆庫(kù)。如此,單神經(jīng)元特異性表達(dá)啟動(dòng)子便可以與任意基因組合構(gòu)建表達(dá)載體,實(shí)現(xiàn)了較強(qiáng)的通用性。通過(guò)連接破傷風(fēng)桿菌神經(jīng)毒素TeTx、線蟲(chóng)基因、熒光蛋白等基因組成表達(dá)載體的方法,對(duì)這些啟動(dòng)子進(jìn)行了表達(dá)驗(yàn)證,同時(shí)對(duì)標(biāo)記相同神經(jīng)元的啟動(dòng)子進(jìn)行了比較。

3、然而,線蟲(chóng)中能被單啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)特異性表達(dá)標(biāo)記的神經(jīng)元數(shù)量有限,被證實(shí)不足20個(gè)。運(yùn)用位點(diǎn)特異性重組酶Flp/Frt、Cre/LoxP系統(tǒng)結(jié)合Gateway技術(shù)可實(shí)現(xiàn)多啟動(dòng)子重疊表達(dá)神經(jīng)元的標(biāo)記。為實(shí)現(xiàn)多順?lè)醋釉诰€蟲(chóng)相同組織同時(shí)表達(dá),線蟲(chóng)中第二種反式剪接的splicedleader(SL2)被應(yīng)用了進(jìn)來(lái)。SL2e連接熒光蛋白,對(duì)其介導(dǎo)的多順?lè)醋颖磉_(dá)效果進(jìn)行了激光掃描共聚焦成像分析。
　　建立的這套神經(jīng)元特異性表達(dá)體系可便捷地應(yīng)用于線蟲(chóng)