煙夜蛾感覺神經(jīng)元膜蛋白基因的克隆、序列分析、原核及組織特異性表達.pdf

1、昆蟲的嗅覺對其棲息地的選擇、覓食、群集、繁殖以及信息傳遞等行為都具有重要的作用。對昆蟲嗅覺機理的深入研究，是探索農(nóng)業(yè)害蟲專一性防治的基礎(chǔ)，并有利于探明昆蟲內(nèi)在的行為機制，解釋昆蟲各種生命行為與寄主植物的協(xié)同進化機制，同時還可以為研發(fā)與環(huán)境兼容性好，對天敵無害的高效害蟲引誘劑和趨避劑提供依據(jù)。感覺神經(jīng)元膜蛋白基因（sensory neuron membrane protein， SNMP）是屬于人類基因中CD36基因家族的一類，是CD36

2、家族中唯一在神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)的基因。SNMPs是位于嗅覺受體神經(jīng)元上的嗅覺特異性蛋白，具有2個跨膜區(qū)域，分別位于靠近C2端和N2端，以及一個大的胞外環(huán)。近些年的諸多研究表明，SNMPs在氣味鑒別中可能扮演著重要的角色。在昆蟲中，SNMP/CD36基因家族被分為主要的三個群體，SNMPs屬于群體三，其又被分為兩個小的亞群即SNMP1和SNMP2。本文以煙草、辣椒等經(jīng)濟作物上的主要害蟲煙夜蛾Helicoverpa assulta（Guenée）

3、為研究對象，利用分子生物學(xué)技術(shù)對煙夜蛾感覺神經(jīng)元膜蛋白（SNMP）基因進行了克隆、原核和組織特異性表達，主要結(jié)果如下： （1）根據(jù)棉鈴蟲SNMP基因完整cDNA序列（Genbank accession no．AF462067）設(shè)計特異性引物，利用RT-PCR方法對煙夜蛾SNMP基因完整開放閱讀框架（ORF）進行擴增、克隆并測序。結(jié)果表明：獲得的ORF序列與近緣昆蟲的序列具有高度的一致性；序列分析結(jié)果表明，煙夜蛾SNMP基因ORF

4、全長1572 bp，編碼523個氨基酸殘基，預(yù)測分子量為59．2 kDa，等電點為6．54，該基因暫命名為HassSNMP。序列比對結(jié)果表明，煙夜蛾與其他昆蟲的SNMP1基因推導(dǎo)表達的氨基酸序列具有較高的一致性，屬于SNMP1。根據(jù)氨基酸序列建立系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，兩近緣種煙夜蛾和棉鈴蟲的SNMP聚在了一起，與其它幾種昆蟲的SNMP各自分開。此結(jié)果在一定程度上說明，昆蟲的親緣關(guān)系越近，其氨基酸同源性越高。同源性分析表明，煙夜蛾SNMP

5、基因與其它鱗翅目昆蟲的SNMP基因同源性較高，達70％以上，其中與棉鈴蟲和煙芽夜蛾的同源性達97％和95％。 （2）在預(yù)測HassSNMP跨膜區(qū)時發(fā)現(xiàn)，HassSNMP與HarmSNMP一樣也具有兩個跨膜區(qū)而且位置是一樣的，這表明HassSNMP具有膜蛋白的典型特征。 （3）成功構(gòu)建了煙夜蛾SNMP基因的原核表達載體，分別導(dǎo)入大腸桿菌BL21（DE3）細胞中，經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)以及SDS-PAGE和Western blot

6、分析，結(jié)果表明，煙夜蛾SNMP基因雖然可在大腸桿菌中轉(zhuǎn)錄，但目的蛋白不能正常表達。 （4）利用RT-PCR方法，研究了SNMP基因在煙夜蛾不同發(fā)育期和不同組織中的表達，結(jié)果表明，SNMP在煙夜蛾觸角、頭（去掉觸角）、喙和足中表達，其中在觸角中的表達量最高，且在雌雄觸角中的表達量差異不顯著，在喙中也有較高的表達量，而在胸和腹中沒有表達；此外，在成蟲、十日齡蛹以及卵中也有該基因的表達，但在卵內(nèi)的表達量相對較低，在幼蟲、一日齡蛹、四日