煙夜蛾氣味受體基因和精氨酸激酶基因的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、昆蟲(chóng)的嗅覺(jué)系統(tǒng)是一個(gè)高度專一和極其靈敏的化學(xué)檢測(cè)器,可以識(shí)別環(huán)境中特異性的化學(xué)氣味分子,并依此作為覓食、求偶、選擇寄主及產(chǎn)卵場(chǎng)所和躲避天敵的信息,因此開(kāi)展氣味受體研究,對(duì)于探明昆蟲(chóng)識(shí)別氣味分子機(jī)理有重要的意義；而在昆蟲(chóng)識(shí)別氣味分子的過(guò)程中,氣味受體引起的下游反應(yīng)和氣味結(jié)合蛋白對(duì)氣味分子運(yùn)輸都需要能量的參與,而精氨酸激酶在能量代謝過(guò)程中起重要作用,對(duì)二者進(jìn)行研究期望為昆蟲(chóng)識(shí)別氣味分子過(guò)程的探明提供一些試驗(yàn)依據(jù)。
　　 本文主要研究

2、內(nèi)容包括:煙夜蛾氣味受體基因的克隆和組織表達(dá)；精氨酸激酶基因的克隆、在煙夜蛾不同組織、發(fā)育期的表達(dá)以及高低溫的誘導(dǎo)表達(dá)。主要研究結(jié)果如下:
　　 (1)利用RT-PCR方法,獲得了煙夜蛾氣味受體基因長(zhǎng)度為1197bp的cDNA閱讀框架(ORF)；該基因推導(dǎo)表達(dá)399個(gè)氨基酸殘基,推測(cè)編碼蛋白質(zhì)的分子量46.6KD,等電點(diǎn)為5.82。利用生物信息學(xué)在線工具SOSUI對(duì)HassOR18受體的氨基酸序列的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè),結(jié)果表明,序

3、列中含有7個(gè)跨膜區(qū),具有昆蟲(chóng)氣味受體典型的結(jié)構(gòu)特征。氨基酸序列比對(duì)表明,獲得cDNA所編碼的氨基酸與其他夜蛾科昆蟲(chóng)HassOR18氣味受體的氨基酸序列的一致性均達(dá)80％以上,因此,將此基因暫命名為HassOR18,該基因已在GenBank中登錄,登錄號(hào)為HM750915。
　　 (2)利用熒光定量PCR方法,研究了HassOR18基因在煙夜蛾不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平,結(jié)果表明,HassOR18基因在雌雄蟲(chóng)觸角中和雌蟲(chóng)喙內(nèi)表達(dá),而且雄

4、蟲(chóng)觸角遠(yuǎn)高于雌蟲(chóng)觸角和雌蟲(chóng)喙內(nèi)的表達(dá)量。
　　 (3)利用RT-PCR和3’RACE-PCR方法擴(kuò)增獲得了煙夜蛾精氨酸激酶基因的cDNA序列,序列分析結(jié)果表明,該基因片段編碼區(qū)長(zhǎng)為1068 bp,3’端非編碼區(qū)長(zhǎng)為238 bp,編碼區(qū)推導(dǎo)表達(dá)356個(gè)氨基酸殘基,預(yù)測(cè)所編碼的蛋白質(zhì)分子量為40.0 KD,等電點(diǎn)為5.76。Prosite功能序列分析結(jié)果表明,該AK氨基酸序列中的氨基酸CPTNLGT。(270-276)、第61位天冬

5、氨酸(Asp)和第192位的精氨酸(Arg)高度保守,而且CPTNLGT是AK的活性中心部位序列,其中第270位的半胱氨酸(C)是AK所必需的酶活性位點(diǎn),第61位的天冬氨酸與第192位的精氨酸可以形成離子偶結(jié)構(gòu)。煙夜蛾與其他昆蟲(chóng)的AK基因的氨基酸序列一致性都在70％以上,該基因暫命名為HassAK,已在Genbank上登錄,登錄號(hào)為HQ336337。
　　 (4)利用熒光定量PCR方法,研究了HassAK基因在煙夜蛾不同發(fā)育期和

6、組織中的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明,HassAK基因在4齡幼蟲(chóng)期和預(yù)蛹期轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)較高；在4齡后轉(zhuǎn)錄水平逐漸降低,到5齡第2天達(dá)到最低,之后逐漸上升并在預(yù)蛹期達(dá)到最大轉(zhuǎn)錄水平,之后逐漸降低。推測(cè)該基因可能受蛻皮激素調(diào)控。在不同組織中,HassAK基因在腹足、中腸中的轉(zhuǎn)錄水平較高,在頭部、脂肪體和表皮中的轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)較低。
　　 (5)利用逆境條件刺激和熒光定量PCR方法,研究了高溫、低溫條件處理后,HassAK基因在5齡煙夜蛾幼蟲(chóng)脂肪