玉米精氨酸酶基因ZmArg的克隆與遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、采用基因工程技術(shù)進(jìn)行作物種質(zhì)創(chuàng)新和品種選育已經(jīng)成為作物育種的重要手段。目前抗蟲、抗除草劑等轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、棉花、油菜等作物已實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，且面積逐年增加。關(guān)于高產(chǎn)轉(zhuǎn)基因的研究起步雖然較晚，但國內(nèi)外發(fā)展速度很快，美國孟山都公司已將高產(chǎn)轉(zhuǎn)基因玉米新品種的選育作為研發(fā)的重要目標(biāo)之一。國內(nèi)高產(chǎn)轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)展也很迅速，已經(jīng)克隆了水稻精氨酸酶等高產(chǎn)相關(guān)基因并進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化，取得了較好的效果。精氨酸是植物中重要的氮素儲藏物質(zhì)，同時也是多胺和一氧化氮等

2、重要信使分子的前體物質(zhì)，過量表達(dá)精氨酸酶基因可以提高植物氮素利用效率，增強物質(zhì)積累，從而增加籽粒產(chǎn)量。為加快我國高產(chǎn)轉(zhuǎn)基因玉米研究與產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程，縮小與國際先進(jìn)水平的差距，本研究采用同源序列克隆方法，從玉米中克隆精氨酸酶基因ZmArg，構(gòu)建單子葉植物過表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和花粉管通道法轉(zhuǎn)化玉米自交系，并對轉(zhuǎn)基因后代進(jìn)行分子驗證、酶活性檢測和產(chǎn)量測定，旨在篩選和創(chuàng)制高產(chǎn)轉(zhuǎn)基因玉米新種質(zhì)，為選育高產(chǎn)轉(zhuǎn)基因玉米新品種提供技術(shù)支撐和材料支持

3、。
　　 主要研究結(jié)果如下:
　　 1.依據(jù)Genbank中玉米精氨酸酶的基因序列，應(yīng)用RT-PCR同源序列克隆的方法，從玉米自交系鄭58中克隆出精氨酸酶基因ZmArg，并用In-Fusion克隆技術(shù)構(gòu)建了玉米單子葉植物過表達(dá)載體pCAMBIA5300-Ubi-ZmArg;
　　 2.采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和花粉管通道法，將ZmArg基因轉(zhuǎn)入11份優(yōu)良玉米自交系中，獲得了67份T2代PCR陽性株系;Southern雜交

4、檢測出現(xiàn)兩條雜交信號，表明其可能為雙拷貝;
　　 3.對以K10、KF298、KF513為受體的轉(zhuǎn)基因T2代株系進(jìn)行全生育期的精氨酸酶活力測定，結(jié)果表明，所有材料的酶活力大致呈現(xiàn)由低到高再降低的變化曲線，干種子酶活力最低，拔節(jié)期達(dá)到最高水平，從拔節(jié)期往后開始呈遞減趨勢，其中受體為KF513的轉(zhuǎn)基因株系E65-9在拔節(jié)期的精氨酸酶活力最大，為0.0876 mmol/L/min;與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾?，轉(zhuǎn)基因材料的精氨酸酶活力除E1-1

5、(K10)在開花期有所降低外，其他時期和其他材料的各個時期的精氨酸酶活力均高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?其中以株系E61-3(KF298)的增加幅度最大;
　　 4.對以K10、KF298、KF513為受體的轉(zhuǎn)基因T2代株系進(jìn)行表型和產(chǎn)量性狀測定，粒長、粒寬、百粒重等比非轉(zhuǎn)基因?qū)φ斩加兴黾?，其中E1-1(K10)、E61-3(KF298)和E65-9(KF513)百粒重分別比對照增加了9.26％、12.94％和14.16％;田間調(diào)查顯示株