精氨酸脫酰酶的克隆、表達(dá)與修飾研究.pdf

1、目的：合成編碼支原體精氨酸脫酰酶(ADI)的基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體，獲得高水平表達(dá)支原體精氨酸脫酰酶的工程化菌種；探索用聚乙二醇修飾支原體精氨酸脫酰酶的反應(yīng)條件，建立PEG化支原體精氨酸脫酰酶(PEG—ADI)的制備工藝；探索修飾混合物的分離純化工藝，獲得PEG—ADI純品；建立活性測(cè)定方法，并研究修飾物活性。 方法: 采用化學(xué)合成方法和DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)合成編碼支原體精氨酸脫酰酶的基因。采用pBV220質(zhì)粒

2、構(gòu)建原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選氨芐青霉素抗性克隆。采用5升發(fā)酵系統(tǒng)進(jìn)行發(fā)酵研究。采用分子量20kD的聚乙二醇修飾精氨酸脫酰酶。探索溫度、攪拌、反應(yīng)時(shí)間等因素對(duì)反應(yīng)效率的影響。采用凝膠層析等方法對(duì)修飾產(chǎn)物進(jìn)行分離純化。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)蛋白質(zhì)分子量；采用C18反向高效液相色譜分析修飾產(chǎn)物純度；采用體外精氨酸降解方法研究修飾產(chǎn)物的活性。 結(jié)果: 獲得了編碼支原體精氨酸脫酰酶的全長(zhǎng)DNA，成功構(gòu)建了原核表

3、達(dá)載體pBV220-ADI，獲得了表達(dá)支原體精氨酸脫酰酶的大腸桿菌菌種，目標(biāo)蛋白表達(dá)量占全菌蛋白的30％以上；表達(dá)產(chǎn)物主要以包含體形式存在；發(fā)酵實(shí)驗(yàn)表明工程菌能夠大規(guī)模制備，表達(dá)穩(wěn)定；建立了聚乙二醇修飾精氨酸脫酰酶的化學(xué)反應(yīng)工藝；建立了修飾產(chǎn)物的分離純化工藝。通過(guò)二次凝膠排阻層析方法可以充分分離單一修飾產(chǎn)物，獲得了單修飾產(chǎn)物純品；成功建立了精氨酸降解法來(lái)測(cè)定產(chǎn)物活性的質(zhì)量控制方法，未修飾ADI與PEG—ADI的比活性分別為40IU/mg

4、和30IU/mg；聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)ADI和PEG—ADI的分子量分別約為45kD和65kD；高效液相檢測(cè)結(jié)果顯示PEG—ADI純度大于95％。 結(jié)論: 本研究通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)獲得了支原體精氨酸脫酰酶的高效表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物以包含體形式存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。小試發(fā)酵表明該菌種可以進(jìn)行放大生產(chǎn)，這為繼續(xù)進(jìn)行ADI深層次研究奠定了基礎(chǔ)；建立了優(yōu)化的聚乙二醇修飾精氨酸脫酰酶的反應(yīng)條件，明確了最佳反應(yīng)參數(shù)，為大規(guī)模制備PEG—ADI提