N-乙酰鳥氨酸脫?；富钚灾行牡难芯?pdf

1、大腸桿菌中由argE基因編碼的N-乙酰鳥氨酸脫?；?N-acetylornithine deacetylase，簡稱NAOase；EC3.5.1.16)，可選擇性地作用于L-型?；被?，且具有較廣泛的底物特異性，能立體拆分消旋化氨基酸生產(chǎn)L-氨基酸。此外，對該酶的研究還具有理論意義和潛在的醫(yī)藥應用價值。迄今為止尚無NAOase三維結構的相關報道。
　　 本文首先運用生物信息學軟件分析NAOase的一級結構，即NAOase主

2、肽鏈由383個氨基酸組成，理論等電點為5.54，相對分子質量為42kD。由于NAOase與已知金屬酶ACDase，CPG2、DEPE、ACY1、YSCS同源，預測分析得NAOase也是一種金屬酶，而且酶活力的表現(xiàn)依賴于鋅離子的存在。
　　 其次預測分析NAOase的高級結構及其活性中心的組成，分析其結構特點。NAOase屬于肽酶M2OA家族ArgE亞家族，12-383肽段是肽酶M20/M25/M40特征區(qū)域。每條亞基由19個β折

3、疊和13個α螺旋構成兩個結構域，結構域間以170-180肽段構成的柔性鏈接區(qū)相連。酶的活性中心位置由4個β折疊形成中空，外繞6個長度不等的α螺旋，呈環(huán)繞的α/β拓撲結構，與M2OA族的ACDase，CPG2，DAPE結構相似。β折疊與鄰近的α螺旋中的氨基酸相互作用，形成一個細小狹長且深的口袋，為底物專一結合區(qū)。該處主要由Asp82，Asp112，Glu144-145，His355構成，即Asp，Glu，His三種氨基酸為酶活性中心的重要

4、氨基酸。其中Glu144，Asp82是催化位點，Glu144為質子受體，Hissss，Asp112，Glu145可能是底物結合位點。
　　 本文通過對酶活性中心的金屬離子的結合的研究，驗證了NAOase確實是金屬酶。制備SDS-PAGE電泳純的純酶是研究前提。NAOase是胞內酶，對于100mL10％的菌懸液，200W超聲5s，間歇5s，全程10min是菌的最佳破碎條件。以硫酸銨分級沉淀進行酶液的粗分離，NAOase主要集中在4

5、0％～50％的硫酸銨級分內，然后采用Ni-NTA親和層析進一步純化，經(jīng)階段洗脫后可得SDS-PAGE電泳純的酶。純化過程的總回收率為38.3％，純化倍數(shù)為59.9。采用硫酸銨沉淀和一步親和層析分離得到電泳純的NAOase，簡化了純化步驟。
　　 其次，酶反應體系中金屬離子的存在確實對酶活力有較大的影響。Co2＋對酶活力有明顯促進作用，最適用量為0.1mmol/L；反應體系中外加Zn2＋、Ni2＋、Cu2＋對酶反應有明顯抑制作用，

6、Zn2＋離子濃度越高，抑制作用越強；Mg2＋、Mn2＋、Fe3＋對酶活的影響不大；低濃度的Mn2＋對酶活有促進作用。
　　 第三，自然酶、Zn2＋脫輔酶及Zn2＋重構全酶的活力比較證實了NAOase為依賴于Zn2＋的金屬酶。Zn2＋在酶分子內的作用類似于氨基酰化酶中，既維護酶分子活性部位的特定空間結構又參與酶和底物的反應過程，起電子傳遞作用。自然酶、Co2＋脫輔酶及Co2＋重構全酶活力的對比實驗證明了Co2＋不參與活性中心的組成

7、，可能在活性中心外起到傳遞電子和穩(wěn)定酶分子構象的作用。
　　 第四，考察酶活性中心重要氨基酸的組成及它們在活性中心的位置確定。采用苯甲基磺酰氟(PMSF)、N-溴代琥珀酰亞胺(NBS)、5，5-二巰基-2，2-二硝基苯甲酸(DTNB)、焦碳酸乙二脂(DEPC)、N-ethyl-5-phenylisoxazolium-3’-sulfonate(WRK)五種化學試劑，分別選擇性修飾NAOase中Ser的羥基、Trp的吲哚基、Cys的

8、巰基、His的咪唑基、Asp/Glu的羧基，結果顯示His和Asp/Glu為酶活性中心內的重要氨基酸，而Ser、Trp和Cys不參與酶活性中心的形成。其中，His對底物和酶的結合起關鍵作用，Asp/Glu參與形成酶的催化中心。
　　 綜上所述，本文綜合多種生物信息學軟件預測得NAOase為金屬酶，其活性中心Asp，Glu，His三種氨基酸組成，其次采用親和層析分離方法得到SDS-PAGE電泳純的NAOase，考察金屬離子對NAO