精氨酸修飾的羥基磷灰石納米基因載體的研究.pdf

1、基因治療是惡性腫瘤等重大疾病治療的最新策略，基因載體是基因治療的關(guān)鍵技術(shù)之一，但現(xiàn)有的病毒型載體安全性和非病毒型載體低效率嚴(yán)重制約了其臨床應(yīng)用。羥基磷灰石(HAP)是人體骨骼的主要成分，具有天然的生物相容性，與蛋白和基因有高親和性，且HAP納米顆粒本身對(duì)癌細(xì)胞具有抑制性能。前期研究顯示HAP納米顆粒是一種極具應(yīng)用潛力的基因載體材料，但需要進(jìn)一步提高其基因轉(zhuǎn)染效能，并闡明其細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及其與載體微結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系。
　　本論文選擇了一

2、種水熱合成法制備的稀土金屬摻雜的精氨酸表面修飾羥基磷灰石(HAP/Arg)納米顆粒為研究對(duì)象，闡明HAP/Arg納米顆粒的基因負(fù)載與釋放機(jī)理，并將其作用于體外培養(yǎng)的人正常血管內(nèi)皮細(xì)胞和人腫瘤細(xì)胞Hela細(xì)胞，考察HAP/Arg納米顆粒的負(fù)載基因的轉(zhuǎn)染活性和生物安全性，實(shí)時(shí)觀察HAP/Arg納米顆粒的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)入胞過程，并闡釋與細(xì)胞相互作用的入胞機(jī)制。主要內(nèi)容及結(jié)論歸納如下:
　　1)以HAP納米顆粒液相可控合成及其功能化研究為基礎(chǔ)，

3、水熱法制備了結(jié)晶程度比較高、晶形完整的HAP/Arg納米顆粒。研究發(fā)現(xiàn)，精氨酸修飾的HAP納米顆粒與沒添加精氨酸合成的HAP納米顆粒在結(jié)構(gòu)上基本一致。但精氨酸的加入在一定程度上抑制了HAP納米顆粒的生長(zhǎng)速率，與沒添加精氨酸合成的HAP納米顆粒相比，其長(zhǎng)徑比有所減小，呈短棒狀，表面電荷由荷負(fù)電轉(zhuǎn)為荷正電。從而為提高HAP納米顆粒的基因轉(zhuǎn)染效能奠定了基礎(chǔ)。其次，少量稀土離子Eu或Tb摻雜不影響合成的HAP/Arg納米顆粒產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，均為單一

4、的HAP納米顆粒物相，在相應(yīng)可見光波段范圍內(nèi)均有發(fā)射特征峰，激發(fā)后分別可發(fā)出較強(qiáng)的特征紅光和綠光，從而使HAP/Arg納米顆粒具有發(fā)射熒光性能。
　　2)闡明了HAP/Arg納米顆粒的基因負(fù)載與釋放機(jī)理。結(jié)果表明，荷正電的HAP/Arg納米顆粒與帶負(fù)電荷的質(zhì)粒DNA通過靜電結(jié)合能快速形成HAP/Arg-DNA復(fù)合物，且30μg的HAP/Arg納米顆粒至少能結(jié)合1μg DNA。同時(shí)，HAP/Arg納米顆粒對(duì)結(jié)合的DNA有明顯的保護(hù)作

5、用，可免受人體血漿蛋白成分或核酸酶的破壞，從而提高了其轉(zhuǎn)載DNA的體內(nèi)穩(wěn)定性，為體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染創(chuàng)造了良好條件。
　　3)考察了HAP/Arg納米顆粒的體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染活性和生物安全性。研究發(fā)現(xiàn)，HAP/Arg-DNA復(fù)合物可以有效轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，而未經(jīng)精氨酸修飾的HAP納米顆粒不能有效轉(zhuǎn)載質(zhì)粒DNA，對(duì)Hela細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率極低。HAP/Arg納米顆粒各劑量組在不同作用時(shí)間下對(duì)所選擇的人正常血管內(nèi)皮細(xì)胞(HAEC)和人腫瘤細(xì)胞(Hel

6、a)的正常生長(zhǎng)和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)均無明顯影響。動(dòng)物的急性毒性實(shí)驗(yàn)和生殖毒性實(shí)驗(yàn)表明，HAP/Arg納米顆粒各劑量組與對(duì)照組相比均無顯著差異。以上結(jié)果為下一步構(gòu)建一種能高效、安全、簡(jiǎn)便的新型納米基因轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)打下基礎(chǔ)。
　　4)實(shí)時(shí)觀察HAP/Arg納米顆粒的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)入胞過程，并闡釋了其內(nèi)吞入胞作用機(jī)制。研究表明，鋱摻雜的HAP/Arg納米顆粒被人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)攝取后主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，而且大部分分布在細(xì)胞核區(qū)域周圍。并且