納米羥基磷灰石基因載體轉(zhuǎn)染機(jī)制研究.pdf

1、目的:1.模擬體液法合成的羥基磷灰石(HA)納米顆粒的制備和表征及轉(zhuǎn)染效率的研究。2.納米HA/pDNA分散穩(wěn)定性和長期保存方式研究。3.優(yōu)化和合成基于納米HA、pDNA和纖維蛋白的三維基因載體系統(tǒng)的體外研究。4.納米HA/pDNA跨膜及細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的研究。
　　方法:1.在模擬體液法中將K2HPO4·3H2O與CaCl2按Ca/P比例為1.67進(jìn)行配比。反應(yīng)條件設(shè)置為pH值=7.4，溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間為24小時(shí)。然后將沉淀烘

2、干后研磨即獲得粉末。采用XRD、FTIR、TEM等對獲得的納米HA顆粒進(jìn)行表征。結(jié)合DNA后觀察結(jié)合DNA的最小使用量和保護(hù)DNA不受DNaseⅠ降解的性能。采用傳統(tǒng)的水熱合成的HA納米顆粒做對比，研究對HeLa細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。2.在不同的保存溫度(4℃、25℃)和保存時(shí)間（2周、3周）下，分別設(shè)置經(jīng)過凍干或未經(jīng)過凍干的以及經(jīng)過凍干并加入10％蔗糖及未經(jīng)過凍干并加入加入10％蔗糖的幾組納米HA/pDNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，采用熒光素

3、酶活性測定轉(zhuǎn)染效率。并對顆粒大小采用動(dòng)態(tài)光散射(DLS)分析儀分析。3.將不同比例的纖維蛋白原和凝血酶混合來制備纖維蛋白凝膠，并利用掃描電鏡(SEM)對其形貌學(xué)觀察。再將纖維蛋白凝膠與納米HA/pDNA復(fù)合物結(jié)合，轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞。采用堿性磷酸酶熒光分析轉(zhuǎn)染后第1、3、5、7天的基因表達(dá)效率。4.采用不同濃度的非律平和氧化苯砷(PAO)預(yù)先處理Hela細(xì)胞，然后再加入納米HA/pDNA復(fù)合物進(jìn)行轉(zhuǎn)染。采用熒光素酶活性分析轉(zhuǎn)染效率。同時(shí)應(yīng)

4、用MTT法觀察非律平和PAO對細(xì)胞的活性影響。然后采用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞攝取的情況。最后應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡來觀察細(xì)胞的內(nèi)吞及胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)情況。
　　結(jié)果:1.合成的仿生性HA納米顆粒屬于缺鈣型羥基磷灰石，Ca/P比為1.658，結(jié)晶度略差，平均粒徑大小為40.58nm。和人體骨骼成分非常接近。表面帶正電，Zeta電位約1.1±0.6mv，在DNA與HA顆粒的質(zhì)量比為1∶30時(shí)可以完全結(jié)合并有效的保護(hù)DNA不被DNaseⅠ降解。較之傳

5、統(tǒng)水熱法合成的HA納米顆粒在Hela細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率上有所改善。2.含有10％蔗糖的納米HA/pDNA復(fù)合體凍干樣本在4℃下貯存了2到3周后，轉(zhuǎn)染效率和對照組（轉(zhuǎn)染前新合成的納米HA/pDNA復(fù)合體）無顯著性差異，(P＞0.05)。而其余各組在貯存了2到3周后轉(zhuǎn)染效率具有不同程度的下降。DLS分析結(jié)果顯示，含有10％蔗糖的納米HA/pDNA復(fù)合體凍干樣本在4℃、25℃下第2周和第3周的大小與對照組無顯著性差異，P＞0.05。而在其他各組中均

6、發(fā)現(xiàn)達(dá)到微米級的大顆粒。3.SEM中觀察到纖維束厚度在纖維蛋白原/凝血酶比例為0.02纖維束較厚而且不均勻。當(dāng)纖維蛋白原/凝血酶比例從0.02增加到10.00的同時(shí)觀察到纖維束的厚度也增加。基因表達(dá)峰值出現(xiàn)在第三天和第五天之間。基因轉(zhuǎn)染中纖維蛋白原/凝血酶比例0.02組基因表達(dá)上明顯低于后三種凝膠載體。4.非律平處理后的細(xì)胞的基因表達(dá)水平均有下降。PAO處理后的細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染效率也觀察到明顯下降。非律平和PAO濃度范圍內(nèi)Hela細(xì)胞存活

7、率為86～100％。納米HA/pDNA復(fù)合物在Hela細(xì)胞中的攝取率約為93％。熒光共聚顯微鏡下觀察納米HA/pDNA復(fù)合物的細(xì)胞內(nèi)吞作用是網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白共同介導(dǎo)的。
　　結(jié)論:1.利用模擬體液法合成的仿生性HA納米基因載體可以有效的結(jié)合和保護(hù)DNA，并較傳統(tǒng)合成的HA納米顆粒在轉(zhuǎn)染率上有所改善。這類仿生性HA納米基因載體可以作為一種新型的非病毒性納米基因載體。2.混有蔗糖的納米HA/pDNA復(fù)合體凍干樣本其顆粒大小和轉(zhuǎn)染效率