酶法轉(zhuǎn)化制備L-瓜氨酸暨精氨酸脫來(lái)氨基酶的性質(zhì)研究.pdf

1、精氨酸脫亞氨基酶（Argininedeiminase，EC3.5.3.6;ADI）催化L-精氨酸水解為L(zhǎng)-瓜氨酸和氨，與鳥(niǎo)氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶、氨基甲酸激酶共同組成精氨酸脫亞氨基酶途徑，廣泛分布于一些以精氨酸為主要能量來(lái)源的細(xì)菌、古細(xì)菌及少數(shù)低等真核生物中。精氨酸脫亞氨基酶除了可用于酶法生產(chǎn)L-瓜氨酸外，還被證明是一種潛在的抗癌藥物，可有效抑制精氨酸缺陷型腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)（如黑色素瘤、肝癌細(xì)胞），抗白血病作用等，在醫(yī)療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

2、目前，研究人員已經(jīng)在大腸桿菌中克隆表達(dá)了來(lái)源于支原體(Mycoplasma)、假單胞菌（Pseudomonasplecoglossicida）、鏈球菌（Streptococcussanguis）、賈第鞭毛蟲（GiardiaIntestinalis）等微生物的ADI基因。但是，它們?cè)诖竽c桿菌中主要以包涵體形式存在，活性較低，不利于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)L-瓜氨酸及作為抗腫瘤制劑的研究。
　　本文分別選取生活環(huán)境差異顯著的云南騰沖嗜熱桿菌（T

3、hermoanaerobactertengcongensisMB4）、惡臭假單胞菌（PseudomonasputidaATCC4359）及威爾李斯特菌(Listeriawelshimeriserovar6bstr.SLCC5334P)的ADI基因序列，分別命名為TADI、PADI、LADI。同源性比對(duì)結(jié)果顯示:三種ADI的氨基酸序列之間差異較大，同源性較低，暗示其可能存在較為顯著的性質(zhì)差異，有利于發(fā)掘新穎特性，應(yīng)用于酶法制備L-瓜氨酸及

4、抗腫瘤制劑研究。
　　在大腸桿菌系統(tǒng)中，通過(guò)構(gòu)建多種不同類型的表達(dá)載體，優(yōu)化培養(yǎng)條件，三種重組蛋白仍主要以無(wú)活性的包涵體形式存在。通過(guò)探索，本論文發(fā)現(xiàn)了一種新的促進(jìn)精氨酸脫亞氨基酶高效水溶性表達(dá)的方法。在分子伴侶GroEL-GroES共表達(dá)的基礎(chǔ)上，在LB培養(yǎng)基中通過(guò)添加0.5％D-葡萄糖和0.5％L-精氨酸進(jìn)行共誘導(dǎo)培養(yǎng)，可分別使rPADI、rLADI的水溶性產(chǎn)量顯著提高至15、7倍。然而，rTADI蛋白通過(guò)截短表達(dá)、體外復(fù)性、

5、分子伴侶共表達(dá)等多種優(yōu)化策略均未能獲得活性蛋白。
　　通過(guò)鎳柱親和層析純化得到天然的rPADI和rLADI蛋白，分別對(duì)其進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)研究。rPADI的最適溫度為40℃，最適pH為6.0，比酶活為76±0.03U/mg，Km值為0.34mM，水溶性產(chǎn)量可達(dá)到45-50mg/L，其催化能力及水溶性產(chǎn)量均位于文獻(xiàn)報(bào)道的中上游水平。rLADI的最適溫度為45℃，最適pH為6.0，比酶活為3.12±0.01U/mg，Km值為46.2mM。

6、Cr3+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Hg2+、SDS、DTT可強(qiáng)烈抑制rLADI的活性。溫度和pH的輕微變化，金屬離子及化學(xué)試劑的存在均會(huì)顯著影響rLADI的催化能力。鑒于rPADI在水溶性、催化能力等方面的優(yōu)勢(shì)，本文利用rPADI的粗酶液直接進(jìn)行L-瓜氨酸的轉(zhuǎn)化研究，發(fā)現(xiàn)25ml重組菌體制備的粗酶液可將20gL-精氨酸有效轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-瓜氨酸，轉(zhuǎn)化率高于90％，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
　　探尋高水溶性及高催化能力的精氨酸脫亞氨基酶