微生物法發(fā)酵生產(chǎn)L-精氨酸的研究.pdf

1、本論文應(yīng)用代謝控制發(fā)酵原理，系統(tǒng)地研究了L-精氨酸產(chǎn)生菌的選育、代謝流量分析以及搖瓶發(fā)酵條件等，主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下： 以谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)GWY020為出發(fā)菌株，經(jīng)化學(xué)和物理誘變處理，用精氨酸甲基酯(AE)、磺胺胍(SG)、D-精氨酸(D-Arg)、脯氨酸(Pro)及琥珀酸(Suc)為唯一碳源平板定向篩選，成功選育出一株L-精氨酸產(chǎn)生菌GU1089(AEr，SGr，Sucg，D

2、-Argr，Pros)。在以葡萄糖為碳源、硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基中發(fā)酵90h，產(chǎn)酸可達(dá)19.27g/L。 建立并完善了谷氨酸棒桿菌GWY020及其2個(gè)逐步疊加不同遺傳標(biāo)記的突變株HUI1821和GUI089合成L-精氨酸的中心代謝網(wǎng)絡(luò)。分別測(cè)定了它們?cè)谔囟ㄅ囵B(yǎng)時(shí)段(50～52h)L-精氨酸等代謝物的胞外濃度，由此計(jì)算這一時(shí)段這些代謝物在發(fā)酵液中積累(或消耗)的速率，分別作出這3株菌在擬穩(wěn)態(tài)下的代謝流量分布圖，進(jìn)而研究育種過(guò)程中不同

3、遺傳標(biāo)記的疊加對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)中L-精氨酸合成流量分布的影響。結(jié)果表明遺傳標(biāo)記的引入使流量分配發(fā)生了重大變化，節(jié)點(diǎn)處的流量分配朝著有利于L-精氨酸合成的方向改變。從代謝流量分析角度上，證明結(jié)構(gòu)類(lèi)似物抗性和敏感性突變是代謝流導(dǎo)向和設(shè)計(jì)育種的有效手段，代謝流量分析將成為設(shè)計(jì)育種的提供新思路。 對(duì)菌株GUI089進(jìn)行了培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化。得到最佳的種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30，玉米漿25，硫酸銨25，KH2PO41，MgSO4·7H

4、2O0.5，碳酸鈣20，pH7.0，同時(shí)確定裝液量25mL/250mL；最佳發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖99.11，(NH4)2SO437.63，玉米漿20.90，KH2PO41.5，MgSO4·7H2O0.6，生物素80μg/L，CaCO325；搖瓶發(fā)酵最佳培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基初始pH7.2，種齡為18h，接種量8％，裝液量為15mL/250mL，往復(fù)式搖床30℃培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速100次/min，發(fā)酵周期90h。優(yōu)化后最終產(chǎn)酸可達(dá)21.70

5、g/L。 結(jié)合菌株GUI089發(fā)酵過(guò)程曲線(xiàn)，對(duì)發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行了補(bǔ)加一些營(yíng)養(yǎng)源的研究，結(jié)果表明，采用恰當(dāng)?shù)姆绞窖a(bǔ)加葡萄糖、谷氨酸和氨水，Lμ精氨酸產(chǎn)酸都有不同程度的提高。 在對(duì)谷氨酸棒桿菌GUI089代謝網(wǎng)絡(luò)和發(fā)酵特性研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)添加適量的氨基酸、有機(jī)酸和維生素等對(duì)L-精氨酸發(fā)酵進(jìn)行代謝調(diào)控。結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分添加物對(duì)L-精氨酸的積累都有一定的影響，特別是L-谷氨酸、L-亮氨酸、L-天冬氨酸、L-纈氨酸、L-精氨酸、草酸、

6、丙二酸、琥珀酸、煙酸、維生素B6、葉酸和硫胺素等添加物對(duì)菌株GUI089合成L-精氨酸明顯有促進(jìn)作用，添加后最大產(chǎn)酸量比不添加任何物質(zhì)提高10％左右。添加蛋白胨和牛肉膏等會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)酸降低，而添加SDS、氯霉素、豆餅水解液和酵母膏等對(duì)產(chǎn)酸有一定的促進(jìn)作用。在培養(yǎng)基中添加表面活性劑吐溫80和穩(wěn)定劑植酸鈉均會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)并導(dǎo)致產(chǎn)酸下降。從代謝層面上分析，這些添加物除了促進(jìn)菌體自身生長(zhǎng)，同時(shí)防止了菌體對(duì)各添加物的過(guò)量合成，強(qiáng)化菌株GUI089合成