精氨酸脫亞胺酶的分泌型表達研究.pdf

1、精氨酸脫亞胺酶(ADI：EC3.4.3.6)是一種精氨酸降解酶,催化精氨酸生成瓜氨酸。ADI廣泛存在于細菌、古細菌、厭氧真核生物中,它是一種治療精氨酸缺陷型腫瘤(如肝細胞癌、黑素瘤)的藥物。本研究室前期從環(huán)境中篩選獲得一株ADI高產(chǎn)菌株,經(jīng)鑒定為Pseudomonas plecoglossicida CGMCC2039。前期研究將該變形假單胞菌來源的ADI在大腸桿菌BL21中進行胞內(nèi)表達,存在包涵體多、純化分離步驟較繁瑣等缺陷。為簡化分

2、離純化并提高該酶作為人類抗癌藥的應用潛力,本論文將變性假單胞菌來源的ADI在畢赤酵母和大腸桿菌中分別進行分泌型表達。
　　 將來源于變形假單胞菌的精氨酸脫亞胺酶(ADI)編碼基因arcA根據(jù)畢赤酵母的密碼子偏好性進行優(yōu)化,然后將優(yōu)化后的基因yh-ADI克隆至表達載體pPIC9K。成功構(gòu)建重組表達載體pVIC9K-yh-ADI。畢赤酵母轉(zhuǎn)化子經(jīng)96孔板傳代培養(yǎng)后,再進行G418篩選獲得多拷貝重組子。對酵母重組子誘導條件的初步優(yōu)化,

3、得到酵母重組子在1％甲醇誘導72 h后ADI活性最高,GS115/pPIC9K-yh-ADI酶活29.0 mU/mL。
　　 同時為了獲得高表達的ADI,還研究了ADI在大腸桿菌中的分泌表達。將變形假單胞菌的精氨酸脫亞胺酶(ADI)編碼基因克隆至具有阿拉伯糖啟動子的分泌型表達載體pBAD/gⅢ B中,經(jīng)鑒定得到重組質(zhì)粒pBAD-ADI。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10F'后進行誘導表達,分別考察了誘導物L-arabinose濃度

4、、誘導溫度及誘導時間對重組蛋白表達的影響,確定最適誘導條件為L-arabinose濃度0.002％(w/v),25℃下誘導5 h,全細胞的酶活為68 mU/mL。采用Osmotic Shock法使ADI從胞周質(zhì)釋放出來,經(jīng)檢測分泌到胞周質(zhì)的重組蛋白活性為53 mU/mL,細胞內(nèi)的酶活為34 mU/mL。SDS-PAGE分析顯示,重組蛋白大小約為46 kDa,與理論結(jié)果一致。
　　 通過ADI在大腸桿菌及畢赤酵母中的分泌表達,得到