精氨酸調(diào)控酪蛋白表達(dá)途徑相關(guān)miRNAs的篩選與表達(dá)分析.pdf

1、功能性氨基酸——精氨酸（Arg）對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞酪蛋白的合成有一定的促進(jìn)作用，本課題組前期研究了精氨酸調(diào)控乳腺上皮細(xì)胞酪蛋白合成途徑中的相關(guān)因子和其功能基因，在此基礎(chǔ)上，本研究將進(jìn)一步探索精氨酸影響奶牛乳腺酪蛋白表達(dá)的miRNA分子機(jī)制。研究包括以下四個(gè)方面部分。
　　試驗(yàn)一精氨酸途徑調(diào)控酪蛋白表達(dá)miRNA的預(yù)測(cè)
　　該試驗(yàn)通過(guò)PicTar和TargetScan兩種可以預(yù)測(cè)靶定目標(biāo)基因的網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行預(yù)測(cè)篩選，對(duì)精氨酸調(diào)

2、控酪蛋白合成通徑相關(guān)功能基因的表達(dá)起調(diào)控作用的miRNA入手，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)對(duì)精氨酸調(diào)控酪蛋白合成通徑相關(guān)功能基因起調(diào)作用的miRNAs。結(jié)果顯示:通過(guò)將兩種數(shù)據(jù)庫(kù)的預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，篩選出精氨酸調(diào)控酪蛋白合成通徑中mmu-miR-325、mmu-miR-3062、mmu-miR-471-3等53個(gè)候選miRNAs可能對(duì)酪蛋白的合成具有調(diào)控作用。
　　試驗(yàn)二體外法檢測(cè)精氨酸途徑調(diào)控酪蛋白合成的重要miRNAs
　　本試驗(yàn)

3、采用本實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)備的二代奶牛乳腺上皮細(xì)胞，添加精氨酸進(jìn)行體外培養(yǎng)，根據(jù)添加的精氨酸的量分為0倍組、1倍組、2倍組，采用RT-PCR方法檢測(cè)所篩選出精氨酸調(diào)控酪蛋白合成途徑相關(guān)的候選miRNAs的表達(dá)情況。結(jié)果顯示:所篩選出的候選miRNAs中有9條: mmu-miR-743a、 mmu-miR-543、mmu-miR-101a、mmu-miR-760-3p、mmu-miR-1954、mmu-miR-712、mmu-miR-574-5p、m

4、mu-miR-468及mmu-miR-875-3p在精氨酸組和對(duì)照組間差異顯著。提示這9條候選的miRNAs可能對(duì)精氨酸調(diào)控酪蛋白合成途徑中相關(guān)功能基因的表達(dá)起調(diào)控作用進(jìn)而影響乳腺上皮細(xì)胞酪蛋白的合成。
　　試驗(yàn)三精氨酸灌注對(duì)奶牛乳腺酪蛋白合成和miRNAs表達(dá)的影響
　　本試驗(yàn)選擇6頭體重、胎次（4胎）、泌乳期（80±2d）、泌乳量（21.0±1.0 kg）、體況(3.0)等基本一致的荷斯坦奶牛作為試驗(yàn)動(dòng)物，分3組，分別為

5、:對(duì)照組、精氨酸組、丙氨酸組，每組2頭試驗(yàn)牛，采用3×3復(fù)拉丁方試驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行頸靜脈灌注。結(jié)果顯示:灌注精氨酸組牛奶中乳蛋白含量和乳品質(zhì)均有提高;酪蛋白的合成量有所提高，CSN1S1、CSN1S2的表達(dá)量顯著提高;另外，體外法檢測(cè)出的差異miRNAs中mmu-miR-743a、mmu-miR-543、mmu-miR-760-3p、mmu-miR-1954、mmu-miR-712、mmu-miR-574-5p都在精氨酸組較高（P＜0.05

6、）;但miR-468在精氨酸組較低(P＜0.05)。提示精氨酸可能通過(guò)影響酪蛋白合成途徑這8條候選miRNAs表達(dá)的機(jī)制來(lái)影響酪蛋白合成通路相關(guān)基因的表達(dá)而最終調(diào)控酪蛋白的合成。
　　試驗(yàn)四頸靜脈灌注精氨酸對(duì)泌乳中期奶牛氮代謝及免疫性能的影響
　　本試驗(yàn)主要研究頸靜脈灌注精氨酸對(duì)奶牛養(yǎng)分消化、氮代謝和免疫性能的影響。試驗(yàn)設(shè)計(jì)同試驗(yàn)三。結(jié)果表明，乳蛋白氮產(chǎn)量在3組之間的差異顯著(P＜0.05)，以精氨酸組最高，丙氨酸組次之，對(duì)

7、照組最低。乳蛋白氮占攝入氮比例也以精氨酸組最高，但組間差異不顯著(P＞0.05)。代謝氮占攝入氮比例為精氨酸組＞對(duì)照組＞丙氨酸組。精氨酸組顯著提高了血清中免疫球蛋白IgG濃度、血漿中總蛋白的濃度及白蛋白與球蛋白比例(P＜0.05）;而谷丙轉(zhuǎn)氨酶及谷草轉(zhuǎn)氨酶等指標(biāo)不受灌注的影響;同時(shí)，該組血清中IL-1、TNF-α水平也較高（P＜0.05）。總結(jié)而言:頸靜脈灌注精氨酸可通提高奶牛對(duì)氮的消化與利用來(lái)提高其乳蛋白的合成量;同時(shí)提高了奶牛血液中