山羊排卵卵泡與從屬卵泡中差異表達(dá)miRNAs的篩選及其功能研究.pdf

1、卵泡排卵是有著諸多因子參與調(diào)控的生殖生理過程，它決定著母畜的排卵數(shù)，影響著母畜的繁殖性能。微小RNA（mircoRNA，或miRNA）是內(nèi)源性非編碼小分子RNA，研究發(fā)現(xiàn)miRNA對(duì)卵泡的生長發(fā)育、閉鎖和黃體形成與消失等過程均有著重要作用，但在卵泡排卵上的研究報(bào)道還相對(duì)較少。本試驗(yàn)以大足黑山羊的排卵卵泡與從屬卵泡為實(shí)驗(yàn)材料，通過Illumina測序、生物信息學(xué)分析及qPCR表達(dá)驗(yàn)證等方法，來篩選與卵泡發(fā)育及排卵有關(guān)的miRNAs。主要實(shí)

2、驗(yàn)結(jié)果如下：
　　1、將大足黑山羊卵泡期卵泡按直徑大小分為六組（GF1~GF6），對(duì)其進(jìn)行sRNA高通量測序，平均得到了12,069,414拷貝的原始序列及11,876,770拷貝的干凈序列。其中長度在22nt的sRNA序列平均占干凈序列的45%，通過將其在參考物種山羊基因組上的定位與miRBase數(shù)據(jù)庫（21.0版本）的比對(duì)，共獲得418個(gè)已知miRNAs序列。同時(shí)，利用miREvo及mirdeep等miRNA預(yù)測軟件預(yù)測到11

3、0個(gè)新的miRNAs序列。
　　2、將GF1~GF6的六組卵泡分為排卵卵泡組（GF_d）和從屬卵泡組（GF_s）進(jìn)行表達(dá)差異分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)9個(gè)miRNAs存在差異（P＜0.01），其中4個(gè)miRNAs（chi-miR-582-5p、novel_130、chi-miR-214-3p及chi-miR-500-5p）在GF_d組中表達(dá)上調(diào)，而5個(gè)miRNAs（chi-miR-383、chi-miR-130b-5p、chi-miR-92a

4、-3p、chi-miR-125b-5p及novel-9）表達(dá)下調(diào)。為篩選更多差異表達(dá)miRNAs，本試驗(yàn)對(duì)六組卵泡進(jìn)行組內(nèi)差異分析，發(fā)現(xiàn)novel-344、chi-miR-10a-5p、chi-miR-10a-3p及chi-miR-196b在GF1中表達(dá)上調(diào)（P＜0.01）。
　　3、利用miRanda軟件及富集通路分析發(fā)現(xiàn)，在上述13個(gè)顯著差異表達(dá)miRNAs中，其預(yù)測靶基因富集到卵巢激素合成通路（chx04913）的有chi-

5、miR-130b-5p、chi-miR-214-3p、novel-344及chi-miR-10a-5p。其中，在排卵卵泡組與從屬卵泡組中差異表達(dá)的chi-miR-130b-5p及chi-miR-214-3p靶向于BMP15、GDF9、CYP19A1和LHR基因。同時(shí)，novel-344和chi-miR-10a-5p與在顆粒細(xì)胞與膜細(xì)胞中表達(dá)的FSHR、GDF9、IGF1R、17β-HSD和LHR基因的mRNA3’UTR序列有結(jié)合位點(diǎn)。<

6、br>　　4、對(duì)同批次GF_d和GF_s樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上述預(yù)測靶基因BMP15、CYP1A1、17β-HSD、IGF1R和LHR在GF_d中均表達(dá)上調(diào)，而GDF9和FSHR表達(dá)下調(diào)。其中，BMP15與chi-miR-130b-5p、FSHR與novel-344以及GDF9與chi-miR-214-3p和chi-miR-10a-5p的上下調(diào)表達(dá)模式相反，符合miRNAs的一般調(diào)控特征。
　　5、選取差異表達(dá)的6個(gè)miR

7、NAs（chi-miR-200a、chi-miR-34c-5p、chi-miR-10a-3p、chi-miR-10a-5p、novel-344和 chi-miR-196b）及3個(gè) mRNA（BMP15、GDF9和BMP6）進(jìn)行qPCR表達(dá)鑒定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Illumina測序分析中得到的表達(dá)模式一致。
　　本試驗(yàn)篩選出了山羊排卵卵泡與從屬卵泡中差異表達(dá)的miRNAs，這些miRNAs與其預(yù)測的靶基因可能參與卵泡中的激素合成過程，從而