精氨酸對乳腺上皮細胞中酪蛋白合成的影響及其調(diào)控機制.pdf

1、該研究以體外培養(yǎng)的中國荷斯坦奶牛乳腺上皮細胞(CCMEC)為試驗模型，研究培養(yǎng)基中不同水平精氨酸(Arg)對乳腺上皮細胞中酪蛋白合成的影響，在此基礎上，進一步研究Arg影響酪蛋白合成的機制，分別從細胞增殖水平，乳酪蛋白基因、酪蛋白合成信號轉(zhuǎn)導相關基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平等方面來進行初步探討。旨在得出Arg影響乳酪蛋白合成的一般規(guī)律，篩選出酪蛋白最大合成量時Arg的濃度;揭示Arg影響酪蛋白合成的細胞分子機制，以為提高牛奶中乳蛋白含量、改善牛

2、奶質(zhì)量提供理論依據(jù)。研究包括四個部分:試驗一奶牛乳腺上皮細胞的體外培養(yǎng)
　　 該試驗以健康的中國荷斯坦奶牛的泌乳期乳腺組織為試驗材料，采用膠原酶消化法在體外培養(yǎng)得到奶牛乳腺上皮細胞，根據(jù)成纖維細胞和乳腺上皮對胰蛋白酶的敏感性不同進行奶牛乳腺上皮細胞的純化，對分離純化的細胞進行傳代、凍存與復蘇。并對得到的細胞進行形態(tài)學、生長特性、免疫組織化學、生物學功能的鑒定。利用臺盼藍計數(shù)法繪制細胞生長曲線，采用免疫組化法對上皮細胞特異性蛋白C

3、K-18的表達進行鑒定，采用RT-PCR技術對乳腺上皮細胞內(nèi)編碼酪蛋白合成的基因CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3的表達進行檢測。結(jié)果顯示:分離得到的細胞呈鵝路石樣，細胞之間連接緊密且界限清晰，單層生長;細胞生長曲線呈S形，具有明顯的潛伏期、指數(shù)生長期、平臺期，細胞于第三天進入指數(shù)生長期于第七天進入平臺期，符合一般的細胞生長規(guī)律;CK-18的免疫組化鑒定結(jié)果呈現(xiàn)出強陽性，說明分離得到的細胞屬典型的上皮細胞;RT-PCR結(jié)果顯

4、示，CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3基因在細胞內(nèi)均能有效的表達，說明分離得到的細胞具有乳腺上皮細胞的特異性生物功能。
　　 試驗二精氨酸對乳腺上皮細胞內(nèi)酪蛋白合成的影響
　　 該試驗以體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞為試驗模型，研究培養(yǎng)基中不同水平的Arg對奶牛乳腺上皮細胞內(nèi)αS、β-酪蛋白合成的影響。試驗采用單因素7水平完全隨機試驗設計，以無Arg的培養(yǎng)基即Arg0倍組(0.00mg/L)為對照，Arg0.25

5、倍組(69.500mg/L)、0.5倍組(139.00mg/L)、1倍組(278.00mg/L)、2倍組(556.00mg/L)、4倍組(1112.00mg/L)、8倍組(2224.00mg/L)為試驗處理組，采用ELISA雙抗夾心法對各個組的細胞內(nèi)αS、β-酪蛋白合成量進行測定。結(jié)果顯示:對于αS-酪蛋白，除了Arg0.25倍組與Arg8倍組，各處理組與對照組相比差異顯著(P＜0.05)，且在Arg2倍組時αs-酪蛋白的合成量達到最大

6、;對于β-酪蛋白，除了Arg0.25倍組，各個處理組與對照組相比差異顯著(P＜0.05)，且在Arg2倍組時β-酪蛋白的合成量達到最大。
　　 試驗三精氨酸對乳腺上皮細胞生長及增殖的影響
　　 該試驗以體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞為模型，研究培養(yǎng)基中不同水平的Arg對奶牛乳腺上皮細胞生長以及細胞增殖活性的影響。試驗設計同試驗二。采用臺盼藍計數(shù)法繪制不同處理組的細胞生長曲線，采用噻唑藍(MTT)法分別檢測各個處理組的24h、

7、48h、72h的細胞增殖活性。結(jié)果顯示，各個處理組的細胞生長曲線均呈S形，在第三天達到指數(shù)期，第七天進入平臺期，進入平臺期后Arg2倍組的細胞數(shù)目高于其他各組;MTT結(jié)果顯示，24h時，Arg0.25-4倍組與對照組相比均差異顯著(P＜0.05);48h、72h時，Arg各組與對照組相比均差異顯著(P＜0.05)。說明精氨酸能促進乳腺上皮細胞的增殖，且在Arg濃度為69.50-1112.00mg/L（0.25倍組-4倍組）時促增殖效果較

8、佳。
　　 試驗四精氨酸對乳腺上皮細胞內(nèi)酪蛋白合成以及信號轉(zhuǎn)導相關基因表達的影響
　　 該試驗以體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞為模型，研究培養(yǎng)基中不同水平的Arg對奶牛乳腺上皮細胞內(nèi)編碼乳酪蛋白合成的基因CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3以及與乳蛋白合成有關的JAK2/STAT5、mTOR信號通路上相關基因JAK2、STAT5、mTOR、S6K、4EBP1的表達的影響。試驗設計同試驗二。以GAPDH為內(nèi)參，采用R

9、eal-TimePCR技術檢測各個處理組的CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3、JAK2、STAT5、mTOR、S6K、4EBP1基因的相對表達量。結(jié)果顯示:對于CSN1S2、CSN2、JAK2基因，除了Arg0.25倍組與Arg8倍組外，其他各處理組與對照組相比顯著上調(diào)其表達(P＜0.05)，對于STAT5、mTOR基因，除了Arg8倍組外，各處理組與對照組相比顯著上調(diào)其表達(P＜0.05)，對于S6K基因，除了Arg0.5

10、倍組外，其他各各處理組與對照組相比顯著上調(diào)其表達(P＜0.05)，對于4EBP1基因，除了Arg0.25倍組外，其他各各處理組與對照組相比顯著下調(diào)其表達(P＜0.05);在Arg2倍組時，CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3、JAK2、STAT5、mTOR、S6K基因的相對表達達到最大且與其他各組差異顯著(P＜0.05)，而4EBP1基因的相對表達量最低且與其他各組差異顯著(P＜0.05)。結(jié)果說明，Arg對編碼乳蛋白合成基因

11、CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3的表達起著重要的促進作用，適宜濃度的Arg能夠促進奶牛乳腺上皮細胞中CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3基因的表達，且當體外細胞培養(yǎng)液中Arg濃度為556mg/L時，這四種酪蛋白基因的表達顯著上調(diào);Arg能夠激活細胞內(nèi)的JAK2/STAT5、mTOR通路從而促進乳蛋白基因的表達，當體外細胞培養(yǎng)液中Arg濃度為556mg/L時，JAK2、STAT5、mTOR、S6K基因的表達均上調(diào)，