GlyRS通過(guò)ELP4調(diào)控奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳蛋白合成的機(jī)理.pdf

1、乳蛋白的合成及調(diào)控是哺乳動(dòng)物乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)非常重要的代謝過(guò)程。乳蛋白合成的機(jī)理是重要的生命科學(xué)基礎(chǔ)問(wèn)題之一，近年來(lái)的研究已有一些明顯的進(jìn)展。已發(fā)現(xiàn)催乳素通過(guò)JAK2/STAT5信號(hào)通路在轉(zhuǎn)錄水平控制乳蛋白生成過(guò)程，氨基酸通過(guò)mTOR/S6K1信號(hào)通路在翻譯水平調(diào)控乳蛋白合成過(guò)程。但乳腺細(xì)胞內(nèi)乳合成的詳細(xì)生化機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甘氨酰tRNA合成酶可以在細(xì)胞核內(nèi)參與調(diào)節(jié)乳蛋白合成，然而具體調(diào)節(jié)作用方式還不知道，闡明此機(jī)制將有

2、助于揭示乳蛋白合成的詳細(xì)分子作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)研究了蛋氨酸刺激下，甘氨酰tRNA合成酶通過(guò)ELP4對(duì)乳蛋白合成的影響，以闡明甘氨酰tRNA合成酶下游信號(hào)分子ELP4的作用機(jī)制。本研究為甘氨酰tRNA合成酶和ELP4對(duì)乳蛋白基因表達(dá)的調(diào)節(jié)及其作用機(jī)理提供基本理論依據(jù)，并為乳蛋白合成的網(wǎng)絡(luò)信號(hào)通路提供了一個(gè)新的視野。
　　本研究選用組織塊培養(yǎng)法，體外培養(yǎng)并得到了純化的奶牛乳腺上皮細(xì)胞，用蛋白質(zhì)免疫印記(WB)和免疫熒光(IF)檢測(cè)細(xì)胞中

3、角蛋白18(CK18)和CSN2的表達(dá)以鑒定細(xì)胞的純度和泌乳功能。實(shí)驗(yàn)通過(guò)在培養(yǎng)液中添加0.6mmol/L的蛋氨酸，建立了細(xì)胞的泌乳模型，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)和WB方法，檢測(cè)添加蛋氨酸泌乳模型中，ELP4的表達(dá)情況。結(jié)果表明，在蛋氨酸促進(jìn)細(xì)胞泌乳時(shí)，ELP4的表達(dá)顯著上升(p＜0.01)。對(duì)ELP4進(jìn)行過(guò)表達(dá)并利用WB檢測(cè)CSN2的表達(dá)，結(jié)果顯示，ELP4過(guò)表達(dá)后CSN2表達(dá)顯著上升(p＜0.01)。這說(shuō)明，在蛋氨酸上

4、調(diào)CSN2表達(dá)的過(guò)程中，ELP4可能是一個(gè)重要的調(diào)節(jié)因子。本實(shí)驗(yàn)用免疫共沉淀(Co-IP)技術(shù)沉淀并鑒定了細(xì)胞中ELP4的相互作用蛋白GlyRS。構(gòu)建真核表達(dá)載體ELP4-EGFP和GlyRS-RFP，應(yīng)用激光能量共振轉(zhuǎn)移(FRET)、定量免疫共沉淀和激光共聚焦共定位等技術(shù)，檢測(cè)添加蛋氨酸對(duì)GlyRS與ELP4相互作用的影響。結(jié)果顯示，添加蛋氨酸泌乳模型中，GlyRS與ELP4的結(jié)合顯著增加(p＜0.01)。對(duì)GlyRS進(jìn)行過(guò)表達(dá)和干擾

5、，WB檢測(cè)ELP4和CSN2的表達(dá)的變化。結(jié)果顯示，GlyRS過(guò)表達(dá)后，ELP4的表達(dá)顯著增加(p＜0.01)，CSN2的表達(dá)顯著增加(p＜0.01); GlyRS干擾后，ELP4的表達(dá)顯著下降(p＜0.01)，CSN2的表達(dá)顯著下降(p＜0.01)。這說(shuō)明，ELP4與GlyRS結(jié)合應(yīng)答蛋氨酸直接參與CSN2合成的調(diào)節(jié)。接著研究了GlyRS過(guò)表達(dá)和干擾后對(duì)p-NFκB1與ELP4的啟動(dòng)子序列結(jié)合情況的影響，結(jié)果表明，GlyRS過(guò)表達(dá)后，