METTL3對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳蛋白和乳脂肪合成的調(diào)控及其作用機(jī)理.pdf

1、乳蛋白和乳脂肪是在哺乳動(dòng)物的乳腺上皮細(xì)胞中被合成的，其合成的過程及調(diào)控是非常重要的代謝過程。乳蛋白和乳脂的合成機(jī)理是很重要的生命科學(xué)問題，近年來，越來越多的研究去揭示乳蛋白及乳脂肪合成的機(jī)理，但是研究進(jìn)展卻很少?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)mTOR信號(hào)通路主要調(diào)控乳蛋白的生成，而SREBP-1c促進(jìn)脂類合成，但氨基酸和激素如何調(diào)節(jié)mTOR和SREBP-1c尚不很清楚。有研究表明，m6A甲基轉(zhuǎn)移酶(methyltransferase-like protein

2、3，METTL3)可以通過調(diào)控mRNA中m6A甲基化水平，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞中蛋白質(zhì)的合成起到重要的調(diào)節(jié)作用，但其是否能夠調(diào)節(jié)乳腺中乳蛋白和乳脂肪的合成尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)首次研究METTL3在牛乳腺細(xì)胞（bovine mammary epithelial cells，BMECs）中對(duì)乳蛋白和乳脂肪的調(diào)節(jié)作用及其分子機(jī)理。
　　本實(shí)驗(yàn)中，采用了組織塊培養(yǎng)法體外培養(yǎng)并純化的奶牛乳腺上皮細(xì)胞，用蛋白質(zhì)免疫印記(Western blotting)

3、和免疫熒光(Imunofluorescience，IF)檢測(cè)細(xì)胞中角蛋白18(CK18)和CSN2的表達(dá)以鑒定細(xì)胞的純度和泌乳功能。
　　應(yīng)用Western blotting檢測(cè)METTL3超表達(dá)和抑制時(shí)METTL3對(duì)BMECs中乳蛋白和乳脂的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)過表達(dá)METTL3時(shí)，mTOR、GlyRS、CSN2、SREBP-1c等表達(dá)量均增加p-mTOR、p-GlyRS的表達(dá)水平也有明顯的升高;當(dāng)抑制METTL3時(shí)，mTOR、G

4、lyRS、CSN2、SREBP-1c等表達(dá)量均減少，p-mTOR、p-GlyRS的表達(dá)水平也有明顯的降低。表明METTL3可以通過調(diào)控乳脂、乳蛋白的相關(guān)信號(hào)通路分子的基因表達(dá)進(jìn)而影響乳脂、乳蛋白的合成。
　　實(shí)驗(yàn)通過建立β-雌激素(E)和蛋氨酸(Met)刺激的BMECs模型，利用IF法檢測(cè)添加E和Met時(shí)METTL3定位和表達(dá)變化。結(jié)果顯示，METTL3主要分布在核內(nèi)，添加E和Met可以上調(diào)METTL3的表達(dá)，增加METTL3的核

5、定位。
　　本實(shí)驗(yàn)選用免疫共沉淀(Co-IP)技術(shù)沉淀并鑒定了細(xì)胞中METTL3的相互作用蛋白GlyRS。結(jié)果顯示，METTL3與GlyRS在胞核中結(jié)合。添加Met或E后利用siRNA對(duì)GlyRS進(jìn)行干擾，應(yīng)用Western blotting檢測(cè)mTOR、CSN2、SREBP-1c、GlyRS、和METTL3的表達(dá)量以及p-mTOR、p-GlyRS表達(dá)水平的變化。結(jié)果顯示，GlyRS干擾后，阻斷了Met和E對(duì)CSN2、SREBP-

6、1c、p-mTOR的蛋白水平的促進(jìn)作用。對(duì)GlyRS進(jìn)行過表達(dá)同時(shí)利用siRNA干擾METTL3，Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)GlyRS后mTOR、CSN2、SREBP-1c、GlyRS和METTL3的表達(dá)量明顯升高，但同時(shí)干擾METTL3后GlyRS對(duì)mTOR、CSN2、SREBP-1c、GlyRS和METTL3的表達(dá)的促進(jìn)作用仍然存在但明顯降低，p-mTOR、p-GlyRS的表達(dá)水平也有明顯的降低。這說明，Gly