脂多糖對泌乳奶牛乳脂肪和乳蛋白影響及其機(jī)理研究.pdf

1、本研究旨在通過體外和半體內(nèi)試驗(yàn)研究LPS對泌乳奶牛乳蛋白和乳脂肪的影響及其機(jī)理。在半體內(nèi)試驗(yàn),通過陰外動脈灌注LPS,研究其對泌乳奶牛血液中脂肪酸組成、氨基酸組成以及生理生化指標(biāo)的影響;在體外試驗(yàn),以乳腺上皮細(xì)胞為模型,研究LPS影響脂肪酸和氨基酸代謝的機(jī)理。
　　 試驗(yàn)一、研究陰外動脈灌注LPS對泌乳奶牛動脈血液中脂肪酸組成、攝取、血液脂質(zhì)指標(biāo)及乳脂成分、乳脂合成前體物和乳脂脂肪酸組成的影響。選用6頭泌乳中后期(185.67±

2、30.11dDIM)、體重相近(576.33±36.67kg)的經(jīng)產(chǎn)荷斯坦奶牛,隨機(jī)分成2組。采用交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì),每期試驗(yàn)7d,間隔期14d;試驗(yàn)組陰外動脈灌注LPS(Escherichia coli Olll:B4,0.01μg/kg體重),對照組陰外動脈灌注生理鹽水。結(jié)果顯示:陰外動脈灌注LPS未顯著影響動脈血漿中脂肪酸的組成(P＞0.05),但有增加血漿中TFA量、SFA含量、SLFA含量和CLFA含量的趨勢。與對照組相比,LPS組

3、不同程度的提高了乳腺對碳鏈長度大于16的脂肪酸攝取率,除對C20的攝取率達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)外,對其余脂肪酸的攝取率影響差異不顯著(P＞0.05)。與對照組相比,動脈血漿中CHOL含量顯著提高(P＜0.05),HDLD含量和LDLD含量有提高的趨勢(P＞0.05)。陰外動脈灌注LPS降低了生鮮乳中乳脂率(P＞0.05)和乳脂肪產(chǎn)量(P＞0.05)。與對照組相比,LPS組血漿中乳脂合成前體物NEFA含量極顯著降低(P＜0.01)

4、,BHA含量呈先降低后升高的趨勢(P＞0.05)。LPS不同程度地降低了乳脂中飽和脂肪酸(P＞0.05)和短鏈脂肪酸(P＞0.05)的含量,提高了乳脂中不飽和脂肪酸(P＞0.05)和中長鏈脂肪酸(P＞0.05)的含量,并影響脂肪酸的去飽和作用。結(jié)果表明,LPS能動員機(jī)體的脂類代謝,以抵抗LPS對動物機(jī)體誘發(fā)的炎癥反應(yīng),LPS是誘發(fā)乳脂發(fā)生變化的主要激發(fā)因子之一。
　　 試驗(yàn)二、研究陰外動脈灌注LPS對泌乳奶牛血液中氨基酸組成和乳

5、蛋白中氨基酸組成以及血液理化指標(biāo)的影響。結(jié)果顯示,LPS顯著提高了乳蛋白率(P＜0.05),酪蛋白含量有提高的趨勢,但影響差異不顯著(P＞0.05)。與對照組相比,乳蛋白產(chǎn)量和酪蛋白產(chǎn)量都有不同程度的降低,但影響差異不顯著(P＞0.05)。生鮮乳中EAA、BCAA含量隨著灌注時間的延續(xù)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(P＞0.05),在灌注后6h達(dá)到最高:生鮮乳中NEAA含量隨著灌注時間的延續(xù)呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(P＞0.05),在灌注后6h達(dá)

6、到最低。與對照組相比,陰外動脈灌注脂多糖對動脈血漿中氨基酸組成沒有顯著影響(P＞0.05),但有提高血漿中his和met含量(P＞0.05)的趨勢,ser、glu、gly、arg、thr、ala、pro、cys、val、lys、iie、leu和phe含量有不同程度的降低(P＞0.05)。陰外動脈灌注脂多糖降低了泌乳奶牛動脈血液中GH含量(P＞0.05)、BUN含量(P＞0.05)、GLB含量(P＞0.05)和TBIL含量(P＞0.05)

7、,提高了動脈血清中胰島素含量(P＞0.05)、GLU含量(P＞0.05)和ALB含量(P＞0.05)。血漿中葡萄糖含量隨著灌注時間呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,灌注后12h達(dá)到最高(P＞0.05)。與對照組相比,陰外動脈灌注脂多糖極顯著提高了動脈血液中ALT活性(P＜0.01)、AST活性(P＜0.01)和ALP活性(P＜0.01),LD活性有所提高,但影響差異不顯著(P＞0.05)。結(jié)果表明,脂多糖動員機(jī)體氨基酸用于急性期反應(yīng)蛋白合成的過程

8、中,干擾了生鮮乳中乳蛋白合成所需氨基酸的量和組成。
　　 試驗(yàn)三、研究陰外動脈灌注脂多糖對泌乳奶牛動脈血漿和生鮮乳中蛋白變化的影響,以揭示脂多糖刺激機(jī)體應(yīng)答的分子機(jī)制。泌乳奶牛經(jīng)陰外動脈注射LPS(0.01μg·kg-1體重)后分別在不同時間點(diǎn)采集奶樣和血樣,采用雙向電泳與質(zhì)譜相結(jié)合的方法,雙向電泳技術(shù)分離蛋白,考馬斯亮藍(lán)G-250染色后用PDQuest8.0.1軟件自動檢測差異蛋白斑點(diǎn),并經(jīng)基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜鑒定

9、。結(jié)果顯示:LPS極顯著影響乳汁中的體細(xì)胞指數(shù)(P＜0.01),在灌注后6h體細(xì)胞指數(shù)達(dá)到最高,此后逐漸下降,24h恢復(fù)到注射前水平。0、6、12和24h血漿蛋白凝膠圖譜分析后發(fā)現(xiàn),8個蛋白點(diǎn)在6、12和24h表達(dá)量升高,質(zhì)譜鑒定為4種蛋白質(zhì)(VD-結(jié)合蛋白前體、絲氨酸蛋白酶抑制劑A3-6、α1-抗胰蛋白酶和絲氨酸蛋白酶抑制劑A3-1前體)。這些蛋白在LPS注射后6、12和24h表達(dá)量顯著高于0h,但它們在6-24h之間的表達(dá)最無顯著差

10、異。0、6、12、24h脫脂乳凝膠圖譜分析后發(fā)現(xiàn),3個蛋白點(diǎn)在12h表達(dá)量升高,質(zhì)譜鑒定為2種蛋白(β-乳球蛋白和α-延伸因子1)。0、6、12、24h乳清蛋白凝膠圖譜沒有明顯的變化。結(jié)果表明,VD-結(jié)合蛋白前體、絲氨酸蛋白酶抑制劑A3-6、α1-抗胰蛋白酶和絲氨酸蛋白酶抑制劑A3-1前體可能在奶牛機(jī)體對LPS刺激應(yīng)答中具有重要作用,其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。
　　 試驗(yàn)四、以泌乳奶牛乳腺上皮細(xì)胞為模型,研究脂多糖對泌乳奶牛乳

11、腺上皮細(xì)胞脂肪酸代謝通路中關(guān)鍵酶和轉(zhuǎn)錄因子基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響。基礎(chǔ)培養(yǎng)基中LPS添加濃度分別為0ng.mL-1、0.1ng.mL-1和10ng.mL-1,培養(yǎng)24h后,采用RT-qPCR檢測目的基因的相對表達(dá)水平。結(jié)果顯示,LPS對乳腺上皮細(xì)胞中脂肪酸結(jié)合蛋白FABP3和FABP4影響差異不顯著(P＞0.05),與對照組相比,LPS極顯著提高了奶牛乳腺上皮細(xì)胞中脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CD36的基因表達(dá)豐度(P＜0.01),并且具有劑量效應(yīng)。與對

12、照組相比,低劑量(0.1ng.mL-1)LPS有提高脂肪酸合成酶FASN、ACACA、ACSS2和脂肪酸調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中PPARG與PPARGC1A基因表達(dá)豐度的趨勢(P＞0.05),高劑量(10ng.mL-1)LPS抑制了脂肪酸合成酶FASN、ACACA、ACSS2和脂肪酸調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中PPARG與PPARGC1A基因表達(dá)水平(P＞0.05)。結(jié)果表明,LPS干擾脂肪酸代謝,低劑量(0.1ng.mL-1)LPS動員脂肪酸的代謝,高劑量(10ng

13、.mL-1)LPS抑制脂肪酸的合成,但尚待在蛋白水平進(jìn)一步證實(shí)。
　　 試驗(yàn)五、以泌乳奶牛乳腺上皮細(xì)胞為模型,研究LPS對泌乳奶牛乳腺上皮細(xì)胞mTOR通路和JAK2/STAT5路徑相關(guān)基因表達(dá)的影響?；A(chǔ)培養(yǎng)基中LPS添加濃度分別為0ng.mL-1、0.1ng.mL-1和10ng.mL-1,培養(yǎng)24h后,采用RT-qPCR檢測目的基因的相對表達(dá)水平。結(jié)果顯示,LPS提高了S6K1和4EBP1mRNA的表達(dá)水平(P＞0.05),并

14、且具有劑量效應(yīng)。mTORmRNA的基因表達(dá)水平受LPS影響差異不顯著(P＞0.05)。LPS對JAK2mRNA的表達(dá)水平影響不顯著(P＞0.05),但有提高的趨勢。與對照組相比,LPS顯著提高了STAT5mRNA表達(dá)轉(zhuǎn)錄水平(P＜0.05)。結(jié)果表明,LPS影響乳腺上皮細(xì)胞中蛋白合成通路mTOR相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá),并且具有劑量依賴效應(yīng);LPS提高了乳腺上皮細(xì)胞中JAK2/STAT5路徑中相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。
　　 總體結(jié)論:①當(dāng)

15、泌乳奶牛陰外動脈灌注LPS劑量為0.01μg/kgBW時,泌乳奶牛機(jī)體內(nèi)脂類代謝增強(qiáng),脂解作用增加,以抵抗LPS應(yīng)激誘發(fā)的炎癥反應(yīng);同時,降低乳腺內(nèi)SCFA的合成,提高乳腺對MCFA和LCFA的攝取,但總體降低了乳脂率和乳脂肪產(chǎn)量;其機(jī)制是LPS影響了乳腺內(nèi)脂肪酸的攝取、活化與轉(zhuǎn)運(yùn)等關(guān)鍵合成和調(diào)控基因;總體來說,LPS是誘發(fā)泌乳奶牛乳脂發(fā)生變化的主要激發(fā)因子之一。②當(dāng)泌乳奶牛陰外動脈灌注LPS劑量為0.01μg/kgBW時,LPS動員機(jī)