14-3-3γ調(diào)控脂多糖誘導的奶牛乳腺上皮細胞炎癥反應和泌乳.pdf

1、隨著人們生活水平的不斷改善，奶產(chǎn)品在整個國民經(jīng)濟中所占的地位日益提高。為了提高產(chǎn)奶量，往往在奶牛飼糧中添加大量高精飼料，這樣做雖然在一定程度上提高了奶牛的產(chǎn)奶性能，但卻非常容易引發(fā)瘤胃亞急性酸中毒(subacute rumen acidosis，SARA)。作為一種常見的代謝疾病，SARA的發(fā)病率較高，在奶牛泌乳早期和中期高達20％以上，并且有逐年上升的趨勢，這給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成了極大的經(jīng)濟損失。當SARA發(fā)生時，瘤胃內(nèi)的細菌脂多糖(li

2、popolysaccharid，LPS)濃度增加，刺激機體釋放大量的炎癥細胞因子，致使機體產(chǎn)生一系列的炎癥反應和代謝模式的變化，從而導致奶牛的產(chǎn)奶量和奶品質(zhì)下降。因此，如何抑制LPS誘導的炎性細胞因子的產(chǎn)生，提高產(chǎn)奶量成為我們迫切需要解決的重要奶業(yè)科學問題。
　　14-3-3蛋白家族是高度保守的二聚體蛋白，廣泛地存在于幾乎所有生物體細胞中，在哺乳動物中有7種亞型（β、γ、ε、ζ、η、σ和τ），在抑制細胞凋亡、介導細胞信號轉(zhuǎn)導、調(diào)控

3、細胞周期等方面發(fā)揮著重要作用。大量研究表明，14-3-3γ參與了許多疾病的發(fā)生、發(fā)展過程，并在一些病理過程中表達量升高。這些研究結果提示我們，14-3-3γ可能在提高機體對損傷的反應性以及抗損傷修復等方面非常重要。本項目前期研究結果顯示，奶牛乳腺上皮細胞中14-3-3γ過表達能夠有效促進乳蛋白和乳脂肪的合成，并能夠顯著提高奶牛乳腺上皮細胞的活性。那么，14-3-3γ是否能通過抑制炎癥信號轉(zhuǎn)導通路和促進泌乳功能進而提高SARA奶牛的產(chǎn)奶量

4、和奶品質(zhì)就成為了我們研究的重點。
　　本研究中，利用組織塊培養(yǎng)法成功地獲得了原代奶牛乳腺上皮細胞，并建立了體外細胞泌乳模型;通過檢測不同濃度LPS對奶牛乳腺上皮細胞的毒性作用，篩選出了最佳的LPS濃度用以復制細胞炎癥模型;用CASY-TT方法、LDH活性測定法、吖啶橙熒光染色法和流式細胞技術檢測了奶牛乳腺上皮細胞的活性、增殖能力和凋亡情況;利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法使得14-3-3γ在奶牛乳腺上皮細胞中進行超表達或基因沉默;應用實時熒光定量

5、RT-PCR法及蛋白免疫印跡（Western blotting）技術檢測了泌乳相關基因的mRNA和蛋白表達變化;用Westernblotting技術檢測了β-酪蛋白的表達變化和炎癥通路中相關基因的蛋白表達變化;用實時熒光定量RT-PCR法和ELISA法測定了炎性細胞因子mRNA表達和分泌情況;用甘油三酯試劑盒和乳糖檢測試劑盒檢測了奶牛乳腺上皮細胞中甘油三酯和乳糖的含量變化;用酶活性試劑盒檢測了脂肪酸合成酶活性變化。本實驗研究結果表明:<

6、br>　　1.LPS對奶牛乳腺上皮細胞具有一定的毒性作用CASY分析法、LDH活性測試法、吖啶橙熒光染色法及流式細胞技術的檢測結果表明，LPS可以降低奶牛乳腺上皮細胞的活性和增殖能力、誘導細胞凋亡，并且這種毒性作用具有一定的劑量-效應關系和時間-效應關系。
　　2.LPS影響奶牛乳腺上皮細胞的泌乳功能和泌乳相關基因的表達。
　　①檢測奶牛乳腺上皮細胞分泌甘油三酯、乳糖及β-酪蛋白的結果表明，LPS能顯著降低奶牛乳腺上皮細胞的

7、泌乳功能。當LPS濃度大于等于100ng/mL時，甘油三酯含量與對照組相比較顯著降低(P＜0.05);當LPS的濃度大于等于1000ng/mL時，乳糖含量與對照組相比顯著降低(P＜0.05);當LPS濃度大于100ng/mL時，奶牛乳腺上皮細胞內(nèi)β-酪蛋白的表達降低。
　?、跓晒舛縍T-PCR檢測表明，LPS下調(diào)奶牛乳腺上皮細胞泌乳有關基因的mRNA表達。與對照組相比，1000ng/mLLPS能顯著降低mTOR、STAT5、S6

8、K1、AKT1、4EBP1、PPARγ、SREBP1、FABP3、ACC、FAS和GLUT1的mRNA表達量（P＜0.05或P＜0.01）。
　?、踂estern blotting檢測表明，LPS下調(diào)奶牛乳腺上皮細胞泌乳有關基因的蛋白表達，與對照組相比，1000ng/mL LPS能顯著抑制mTOR、p-mTOR、S6K1、p-S6K1、AKT1、p-AKT1、SREBP1、PPARγ和GLUT1的蛋白表達(P＜0.05)。

9、　　3.LPS引起奶牛乳腺上皮細胞14-3-3γ表達升高，提示14-3-3γ可能參與LPS誘導的炎癥反應過程。
　　4.14-3-3γ超表達抑制LPS誘導的奶牛乳腺上皮細胞分泌炎性因子和下調(diào)炎癥相關信號通路。
　?、贌晒舛縍T-PCR和ELISA檢測表明，14-3-3γ超表達可以明顯抑制LPS誘導的奶牛乳腺上皮細胞中TNF-α、IL-6、IL-1β和iNOS的mRNA表達，并且顯著降低奶牛乳腺上皮細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α

10、和IL-6的含量，與LPS組相比差異顯著(P＜0.05)。
　?、赪estern blotting檢測表明，14-3-3γ超表達抑制TLR4蛋白的表達，下調(diào)NF-κB和MAPK信號通路。14-3-3γ超表達抑制IκB-α、ERK1/2和p38的磷酸化以及NF-κB的核轉(zhuǎn)位，與LPS組相比差異顯著(P＜0.05)。
　　5.14-3-3γ對LPS誘導的奶牛乳腺上皮細胞活性及其泌乳的影響。
　?、貱ASY分析法、流式細胞技

11、術等檢測結果表明，與LPS對照組相比，14-3-3γ超表達促進LPS誘導的奶牛乳腺上皮細胞的活性和增殖能力，抑制細胞凋亡;與LPS對照組相比，14-3-3γ基因沉默抑制LPS誘導的奶牛乳腺上皮細胞活性和增殖能力，促進細胞凋亡，提示14-3-3γ對LPS誘導的奶牛乳腺上皮細胞的損傷有保護作用。
　?、跈z測細胞分泌甘油三酯、乳糖和β-酪蛋白結果表明，與LPS對照組相比，14-3-3γ超表達能促進LPS誘導的奶牛乳腺上皮細胞乳脂、乳糖和

12、乳蛋白的合成和分泌;與LPS對照組相比，14-3-3γ基因沉默抑制LPS誘導的奶牛乳腺上皮細胞乳脂、乳糖和乳蛋白的合成和分泌。
　?、蹮晒舛縍T-PCR及Western blotting檢測表明，與LPS對照組相比，14-3-3γ超表達增加mTOR、S6K1、AKT1、PPARγ、SREBP1和GLUT1的mRNA和蛋白表達量;與LPS對照組相比，14-3-3γ基因沉默減少mTOR、S6K1、AKT1、PPARγ、SREBP1和

13、GLUT1的mRNA和蛋白表達量。
　　綜上，14-3-3γ在奶牛乳腺上皮細胞炎癥反應中發(fā)揮重要的抗損傷保護作用。14-3-3γ可以通過降低NF-κB和MAPK信號通路的活性而抑制TNF-α、IL-6、IL-1β和iNOS的分泌，減輕奶牛乳腺上皮細胞炎癥反應，并且14-3-3γ能增加泌乳相關基因的表達，從而促進LPS誘導的奶牛乳腺上皮細胞的活性、增殖能力和乳成分的合成、分泌。本研究為有效控制LPS引起的奶牛泌乳能力下降和提高乳品質(zhì)