14-3-3γ對奶牛乳腺上皮細胞乳蛋白合成和細胞增殖的調(diào)節(jié).pdf

1、奶牛的乳品質(zhì)是衡量經(jīng)濟效益的重要標準。乳蛋白的含量是牛奶品質(zhì)的一個重要指標。我國奶牛普遍存在乳蛋白含量偏低的重大問題，因此亟需闡明乳蛋白合成的機理，從而找到改善乳品質(zhì)的有效技術(shù)途徑。乳蛋白合成機理是分子生物學和泌乳生理學領(lǐng)域重要的課題之一。目前研究已經(jīng)取得了很多重大的進展，證實了JAK/Stat5和mTOR/S6K1信號途徑對于乳蛋白轉(zhuǎn)錄和翻譯是至關(guān)重要的。另外，乳蛋白合成還直接受到乳腺上皮細胞生長和增殖情況的影響。14-3-3蛋白廣泛

2、分布于各種生物體組織和細胞中，參與很多生物學過程，包括細胞生長、細胞周期、細胞增殖、代謝、信號轉(zhuǎn)導、基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成。14-3-3蛋白決定其底物的亞細胞定位，以促進或抑制信號轉(zhuǎn)導，包括mTOR也能夠被14-3-3調(diào)節(jié)。14-3-3蛋白具有不同的功能，并與很多底物發(fā)生相互作用。盡管進行了廣泛的研究，但14-3-3對蛋白質(zhì)合成以及細胞增殖發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的具體機制仍需進行深入探索。本實驗室前期通過蛋白質(zhì)雙向電泳和質(zhì)譜鑒定分析發(fā)現(xiàn)14-3-3

3、γ與乳蛋白合成相關(guān)，提示14-3-3γ可能參與乳蛋白合成的調(diào)控過程。本研究針對14-3-3γ的泌乳調(diào)節(jié)功能、細胞增殖調(diào)節(jié)功能、相互作用蛋白鑒定等進行分析，旨在揭示14-3-3γ通過互作蛋白調(diào)控乳蛋白合成和細胞增殖的分子機理。
　　實驗首先采用免疫熒光技術(shù)檢測了細胞中cytokeratin18和β-酪蛋白的表達，以鑒定奶牛乳腺上皮細胞的純度和泌乳功能。添加濃度為0.6mM的蛋氨酸處理細胞24h，通過westernblotting技術(shù)

4、檢測蛋氨酸對14-3-3γ和β-酪蛋白表達的影響。利用免疫熒光技術(shù)檢測蛋氨酸對14-3-3γ表達的影響。采用Casy(@) Model DT細胞計數(shù)儀檢測蛋氨酸刺激對細胞數(shù)和細胞活力的影響。采用流式細胞術(shù)檢測添加蛋氨酸后細胞的增殖率和周期的變化。進一步構(gòu)建14-3-3γ的真核表達載體進行14-3-3γ過表達實驗，合成14-3-3γ的抑制片段進行抑制實驗。通過western blotting技術(shù)檢測了14-3-3γ過表達和抑制后mTOR、

5、p-mTOR、Stat5a、p-Stat5a、CyclinD1和β-酪蛋白蛋白質(zhì)水平的變化。利用免疫熒光技術(shù)檢測了14-3-3γ過表達和抑制后對p-mTOR和p-Stat5a水平的影響。采用Casy(@) Model DT細胞計數(shù)儀和流式細胞術(shù)檢測14-3-3γ過表達和抑制對細胞數(shù)、細胞活力、細胞增殖率和細胞周期的影響。實驗進一步通過免疫共沉淀和質(zhì)譜鑒定技術(shù)尋找與14-3-3γ相互作用并且與乳蛋白合成有關(guān)的蛋白質(zhì)，并探究14-3-3γ過

6、表達和抑制對互作蛋白表達的影響，以及過表達互作蛋白后乳蛋白合成的變化。
　　本研究確定了蛋氨酸對14-3-3γ表達和細胞增殖的影響。結(jié)果顯示加蛋氨酸組的細胞中14-3-3γ和β-酪蛋白表達量顯著高于空白對照組。加蛋氨酸使乳腺上皮細胞數(shù)明顯增加，且細胞活力顯著增強。此外，加蛋氨酸組的乳腺上皮細胞增殖率顯著高于空白對照組，加蛋氨酸組的處于S期和G2-M期的乳腺上皮細胞百分比均明顯升高，而G0-G1期細胞百分比明顯下降。這表明乳蛋白合成

7、和細胞增殖與14-3-3γ有關(guān)。
　　本實驗進一步檢測了14-3-3γ過表達和抑制對乳蛋白合成和細胞增殖的影響。結(jié)果顯示14-3-3γ過表達可以上調(diào)mTOR、Stat5a和β-酪蛋白的蛋白質(zhì)表達水平，并促進mTOR和Stat5a兩個蛋白發(fā)生磷酸化，而抑制實驗結(jié)果與過表達相反。過表達14-3-3γ使細胞數(shù)明顯增加，且細胞活力顯著增強。此外，過表達14-3-3γ的乳腺上皮細胞增殖率顯著高于空白對照組和轉(zhuǎn)染空載體組，且處于S期和G2-M

8、期的細胞百分比均明顯升高，而G0-G1期細胞百分比明顯下降。抑制實驗結(jié)果與過表達相反。另外，過表達和抑制14-3-3γ基因的結(jié)果顯示，14-3-3γ正調(diào)節(jié)Cyclin D1的表達。以上實驗結(jié)果表明14-3-3γ正向調(diào)節(jié)mTOR和Stat5a的磷酸化水平從而促進乳蛋白合成和細胞增殖。
　　本實驗對14-3-3γ相互作用蛋白進行了鑒定，共鑒定出44種蛋白質(zhì)與14-3-3γ相互作用，分為8類:與轉(zhuǎn)錄、翻譯、信號轉(zhuǎn)導、細胞增殖、細胞周期、

9、細胞骨架和轉(zhuǎn)運相關(guān)的蛋白以及酶類。蛋白質(zhì)翻譯對于乳蛋白合成至關(guān)重要，因此在翻譯相關(guān)蛋白中選擇了eIF1AX、RPS7和eIF5這3個蛋白作為研究對象，驗證它們與14-3-3γ蛋白是否真的存在相互作用。實驗利用western blotting、免疫熒光共定位和熒光能量共振轉(zhuǎn)移技術(shù)對eIF1AX、RPS7和eIF5與14-3-3γ之間是否存在直接的相互作用進行了驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)eIF1AX、RPS7和eIF5這3個蛋白與14-3-3γ蛋白是特

10、異性結(jié)合的，3個蛋白與14-3-3γ蛋白共定位指數(shù)均在90％以上，3個蛋白與14-3-3γ蛋白的FRET效率均在20％-35％，顯著高于對照組(＜5％)。這表明eIF1AX、RPS7和eIF5這3個蛋白與14-3-3γ蛋白均存在直接的相互作用，14-3-3γ蛋白調(diào)節(jié)泌乳的功能很可能與這3個互作蛋白有關(guān)。
　　本研究進一步檢測了蛋氨酸對eIF1AX、RPS7和eIF5表達的影響。結(jié)果表明，添加蛋氨酸后，細胞中eIF1AX、RPS7、

11、eIF5和β-酪蛋白的表達量均顯著升高，這說明eIF1AX、RPS7和eIF5這3個蛋白可能與乳蛋白合成有關(guān)。
　　本實驗又檢測了14-3-3γ過表達和抑制對eIF1AX、RPS7和eIF5表達的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達14-3-3γ基因后，細胞中eIF1AX、RPS7和eIF5的表達量均顯著增加，而抑制14-3-3γ基因后，細胞中eIF1AX、RPS7和eIF5的表達量均顯著降低。此外，14-3-3γ基因過表達可顯著提高eIF2α