奶牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)及干細(xì)胞鑒定.pdf

1、奶牛乳腺上皮細(xì)胞（dairy cow mammary epithelial cells，DCMECs）作為常用的體外實(shí)驗(yàn)工具，為奶牛乳腺發(fā)育、泌乳調(diào)控及乳腺生物反應(yīng)器等方面的研究提供細(xì)胞模型。目前，DCMECs永生化細(xì)胞系的建立尚未成熟，需要在體外誘導(dǎo)并模擬生理?xiàng)l件，通過(guò)原代培養(yǎng)來(lái)獲得具有泌乳功能的分泌性乳腺上皮細(xì)胞或構(gòu)建三維立體的腺泡模型。乳腺是出生后發(fā)育的器官，青春期首次快速發(fā)育及妊娠期再次發(fā)育都與乳腺干細(xì)胞（mammary ste

2、m cells，MaSCs）活躍的自我更新及分化密切相關(guān)。研究表明乳腺中存在一定比例的干細(xì)胞，但區(qū)分鑒定這些多潛能干細(xì)胞的特異性分子標(biāo)志仍不十分明確。一些激素及生長(zhǎng)因子類物質(zhì)在體內(nèi)能夠促進(jìn)乳腺發(fā)育、調(diào)控泌乳，在體外能夠促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞增殖，影響細(xì)胞黏附、遷移、伸展和分化，并且涉及到對(duì)MaSCs的調(diào)控。激素和生長(zhǎng)因子如何影響MaSCs擴(kuò)增、分化并維持其多能性，以及調(diào)控乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)、分化參與體外立體腺泡構(gòu)建的機(jī)制值得深入研究。
　

3、　本研究以原代培養(yǎng)的DCMECs為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停接懚唐趦?nèi)獲得大量DCMECs的方法，篩選乳腺上皮干細(xì)胞新型分子標(biāo)志，鑒定奶牛乳腺上皮干細(xì)胞，觀察黃苷及IGF-Ⅰ對(duì)乳腺上皮細(xì)胞及乳腺上皮干細(xì)胞的影響。實(shí)驗(yàn)中采用膠原酶消化法體外培養(yǎng)DCMECs，通過(guò)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、核型分析、Western Blotting檢測(cè)酪蛋白、熒光定量PCR檢測(cè)泌乳相關(guān)基因等實(shí)驗(yàn)技術(shù)與方法評(píng)估原代（或傳代）細(xì)胞的生長(zhǎng)活性與泌乳潛能;利用激光共聚焦顯微技術(shù)進(jìn)行免疫熒光

4、觀察與分析，根據(jù)乳腺上皮干細(xì)胞分子標(biāo)志表達(dá)、BrdU標(biāo)記滯留的特點(diǎn)以及細(xì)胞分裂方式鑒定原代乳腺上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)體系中的乳腺上皮干細(xì)胞。
　　結(jié)果表明:
　　(1)主要成分為膠原酶Ⅳ、透明質(zhì)酸酶、DNA酶Ⅰ的消化液混合物在3h內(nèi)高效率消化組織塊，得到的原代及傳代細(xì)胞是具有60條染色體，呈現(xiàn)典型上皮細(xì)胞形態(tài)，CK18表達(dá)陽(yáng)性，生長(zhǎng)活力旺盛，能夠合成分泌β-casein的正常DCMECs，可作為后期實(shí)驗(yàn)材料。
　　(2)在體

5、外培養(yǎng)過(guò)程中，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)分析P0、P3、 P6、P9細(xì)胞中催乳素、生長(zhǎng)激素和胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)及其受體基因的表達(dá)變化，經(jīng)過(guò)比較分析發(fā)現(xiàn)原代與傳代后細(xì)胞在激素、生長(zhǎng)因子及其受體mRNA水平上差異極顯著降低（P＜0.01）。表明在非誘導(dǎo)泌乳分化培養(yǎng)條件下，脫離泌乳生理環(huán)境的DCMECs自身具有的泌乳調(diào)控基因表達(dá)迅速受到抑制。
　　(3)本研究根據(jù)成體干細(xì)胞具有BrdU標(biāo)記滯留的特點(diǎn)檢測(cè)DCMECs中疑

6、似乳腺干/祖細(xì)胞，同時(shí)分析兩種新發(fā)現(xiàn)的MaSCs分子標(biāo)志(FNDC3B和PROCR)的表達(dá)定位，驗(yàn)證應(yīng)用它們指示乳腺上皮干細(xì)胞的可行性。結(jié)果顯示，連續(xù)培養(yǎng)25d后BrdU標(biāo)記滯留上皮細(xì)胞(label-retaining epithelial cells，LRECs)比例接近0.4％，極少數(shù)細(xì)胞呈FNDC3B或PROCR陽(yáng)性，可以觀察到不對(duì)稱分裂細(xì)胞，但在一定培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，DCMECs群體中能夠保留一定比例疑似乳腺干/祖細(xì)胞，提示這些多能奶

7、牛乳腺干/祖細(xì)胞在體外泌乳調(diào)控和乳腺腺泡重塑過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。
　　(4)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期添加黃苷及IGF-Ⅰ，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)分析原代及傳代細(xì)胞中催乳素、生長(zhǎng)激素和IGF-Ⅰ及其受體的基因表達(dá)，以及干細(xì)胞分子標(biāo)志FNDC3B和PROCRmRNA的表達(dá)變化。添加黃苷及IGF-Ⅰ后，P0-P9細(xì)胞PROCRmRNA的表達(dá)量顯著增高（P＜0.05），F(xiàn)NDC3B mRNA的表達(dá)量變化不顯著（P＞0.