奶牛乳腺上皮細胞賴氨酸吸收及代謝機制研究.pdf

1、論文以奶牛乳腺上皮細胞為模型，研究了賴氨酸(Lys)對乳蛋白合成的影響及其機制，探討了Lys在乳腺中的代謝走向，為定向調(diào)控乳蛋白合成及改善乳品質(zhì)提供一定的理論依據(jù)。
　　1.Lys在奶牛乳腺上皮細胞乳蛋白合成中的作用
　　試驗以泌乳中期荷斯坦奶牛乳腺上皮細胞為模型，培養(yǎng)細胞至融合度80％后，用無Lys和無血清的培養(yǎng)基饑餓細胞，使細胞處于同一分化狀態(tài)。培養(yǎng)基中添加不同濃度的Lys（0、0.5、1.0、1.5、2.0、5.0和1

2、0mM）培養(yǎng)細胞6h、12h和24h。利用CCK8法檢測細胞活力，篩選處理細胞最適宜的時間及濃度;利用同位素示蹤技術(shù)L-[ring-3H5]Phenylalanine檢測Lys對奶牛乳腺上皮細胞總蛋白周轉(zhuǎn)的影響;通過RT-qPCR和Western Blot檢測β-酪蛋白以及乳蛋白合成相關信號通路因子的表達豐度。結(jié)果顯示:Lys濃度為1.0mM培養(yǎng)24h時，細胞活力最高;Lys可有效促進細胞總蛋白合成，降低細胞總蛋白降解率;1.0mM L

3、ys能夠有效提高β-酪蛋白的表達;添加1.0mM Lys可顯著提高JAK2-STA5、mTOR等信號通路基因表達。結(jié)果提示:Lys通過促進蛋白周轉(zhuǎn)和乳腺上皮細胞增殖，激活JAK2-STAT5和mTOR等信號通路，提高乳蛋白的合成量。
　　2.奶牛乳腺上皮細胞中Lys吸收機制研究
　　試驗研究了可轉(zhuǎn)運Lys的可能氨基酸(AA)轉(zhuǎn)運載體(CAT-1、b0，+AT/rBAT、y+LAT1/4F2hc、y+LAT2/4F2hc和AT

4、B0，+)在奶牛乳腺上皮細胞中的表達及Lys對其表達的影響。結(jié)果顯示:奶牛乳腺細胞中CAT-1、y+LAT2/4F2hc和ATB0，+均有表達，未發(fā)現(xiàn)b0，+AT/rBAT，y+LAT1/4F2hc的表達;Lys能夠顯著提高奶牛乳腺上皮細胞ATB0,+的表達，且ATB0,+的表達量顯著高于CAT-1，y+LAT2/4F2hc;抑制ATB0，+的轉(zhuǎn)運活性，β-酪蛋白表達明顯下降，提示ATB0,+在Lys轉(zhuǎn)運的過程中發(fā)揮重要作用。
　

5、　3.奶牛乳腺上皮細胞中Lys代謝機制研究
　　試驗采用同位素示蹤技術(shù)，利用L-[14C(U)]Lys檢測奶牛乳腺上皮細胞中Lys的代謝去向，采用0.5、1.0、1.5和2.0mM Lys孵育細胞3h后，RT-qPCR和Western Blot檢測Lys對其代謝關鍵酶（LKR和SDH）表達的影響。結(jié)果顯示:奶牛乳腺上皮細胞中Lys被用于合成蛋白質(zhì)的比例占80％以上，轉(zhuǎn)化成天冬氨酸(Asp)和組氨酸(His)的比例分別為3％-4％，

6、生成CO2的比例為3％-5％;1.5mM Lys明顯提高其代謝酶LKR和SDH mRNA及AASS蛋白表達。結(jié)果提示，Lys在乳腺中大部分被用作底物合成蛋白質(zhì)，少部分轉(zhuǎn)化為非必需氨基酸(NEAA)和氧化供能，濃度為1.0mM時合成蛋白效率最高。
　　綜上所述，Lys可能通過促進奶牛乳腺上皮細胞增殖，激活JAK2-STAT5和mTOR信號通路提高奶牛乳腺上皮細胞細胞蛋白周轉(zhuǎn)和乳蛋白合成;研究發(fā)現(xiàn)ATB0,+、CAT-1和y+LAT2