蛋氨酸、賴氨酸二肽對奶牛乳腺上皮細胞泌乳機能的影響.pdf

1、產奶量低和乳品質低一直是制約我國奶牛業(yè)發(fā)展的重要因素，加大泌乳調控機理研究對我國奶牛業(yè)發(fā)展具有重要的理論價值和應用價值。氨基酸是乳蛋白合成的重要底物，然而隨著氨基酸營養(yǎng)研究的深入，許多學者們發(fā)現(xiàn)血液循環(huán)中的肽不僅參與乳腺細胞中氨基酸的合理供應和乳蛋白的合成，還彌補了乳腺組織對游離氨基酸攝入的不足。近年來有關小肽營養(yǎng)的研究主要側重于日糧中添加小肽對奶牛生產性能影響，而關于小肽對體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞(DCMECs)泌乳機理及調控機制等

2、方面的研究較少。SND1基因是重要的轉錄共激活子，而在DCMECs中的報道還較少。研究小肽營養(yǎng)與乳蛋白合成、乳腺泌乳能力的關系以及小肽與功能基因的互作關系將有助于揭示乳蛋白合成的調控機制。
　　 本試驗成功構建體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞模型，添加不同濃度的蛋氨酸-蛋氨酸、賴氨酸-賴氨酸、蛋氨酸-賴氨酸以及賴氨酸-蛋氨酸二肽，應用CASY細胞活力分析儀檢測體外培養(yǎng)的DCMECs的活力及增殖能力;運用實時熒光定量PCR檢測四種二肽對

3、β-酪蛋白mRNA表達水平的影響，確定四種二肽的最佳添加濃度，并進一步通過Western blot分析添加最佳濃度時泌乳相關蛋白的表達情況。應用免疫熒光細胞染色法檢測SND1、PepT2、STAT5a和p-STAT5a在DCMECs內定位情況，對SND1進行基因沉寂和超表達，通過檢測細胞的活力、增殖能力、mRNA表達以及蛋白表達確定其在泌乳信號通路中的作用。
　　 實驗結果表明，培養(yǎng)24h時四種二肽的最佳添加濃度分別為80μg/

4、ml，100μg/ml，50μg/ml，80μg/ml。定位發(fā)現(xiàn)SND1在DCMECs的細胞核和胞質中都有分布，且主要在細胞核內表達，少量在胞質中存在;PepT2主要在細胞核周圍分布，在細胞核內分布較少，細胞形態(tài)清晰可見;STAT5a和p-STAT5a在細胞核內及胞質中均有表達。SND1的干擾實驗表明最佳的siRNA oligo濃度為25 nmol/mL; SND1干擾后三個基因mRNA表達均與陰性對照組差異顯著，SND1干擾+MK組與

5、SND1干擾組相比，SND1表達無顯著差異，而STAT5a和β-casein表達差異顯著;干擾SND1后，相關蛋白與對照組相比，差異顯著(P＜0.05)，除PepT2與對照組無顯著差異，添加MK后，蛋白的表達量并沒有顯著提高。SND1的超表達實驗表明轉染24h時細胞活力及增殖能力與未轉染組相比差異顯著(P＜0.05)，添加MK后細胞活力及增殖能力有所提高;SND1超表達后三個基因mRNA表達均與空載體組差異顯著(P＜0.05);瞬時轉染