必需氨基酸及蛋氨酸二肽供給模式對(duì)奶牛乳腺組織α-,s--酪蛋白合成的影響.pdf

1、本研究建立了泌乳奶牛乳腺組織體外培養(yǎng)體系及奶牛乳腺組織αs-酪蛋白合成量的Western-blotting檢測(cè)方法(試驗(yàn)一),并利用建立的體系和方法,分別研究了賴氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸和苯丙氨酸濃度對(duì)αs-酪蛋白合成的影響(試驗(yàn)二)；蛋氨酸與蛋氨酸二肽不同組合對(duì)αs-酪蛋白合成的影響(試驗(yàn)三)以及不同氨基酸及二肽組合模式對(duì)αs-酪蛋白合成的影響(試驗(yàn)四)。
　　 試驗(yàn)一、奶牛乳腺組織體外培養(yǎng)體系和αs-酪蛋白Western-blo

2、tting檢測(cè)方法的建立。用貼壁培養(yǎng)法對(duì)乳腺組織進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)條件為:DMEM/F12培養(yǎng)液中含2μg/ml氫化可的松、5μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、10μg/ml胰島素、5μg/ml泌乳素和10％胎牛血清。通過(guò)培養(yǎng)組織形態(tài)觀察和MTT活性測(cè)定,發(fā)現(xiàn)奶牛乳腺組織在培養(yǎng)1d后開始貼壁,培養(yǎng)2d后組織塊完全貼壁,且周圍有成纖維細(xì)胞長(zhǎng)出,說(shuō)明培養(yǎng)的乳腺組織具有增殖活性。MTT值顯示,4d后培養(yǎng)組織的活力達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。
　　 用牛αs-酪蛋白免

3、疫新西蘭兔,獲得兔抗牛αs-酪蛋白多克隆抗體,經(jīng)雙向瓊脂擴(kuò)散檢測(cè)其效價(jià)為1:16,并通過(guò)免疫印跡方法驗(yàn)證其為αs-酪蛋白特異抗體。比較了不同的轉(zhuǎn)膜方法,發(fā)現(xiàn)濕轉(zhuǎn)法更適合培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)膜。
　　 試驗(yàn)二、培養(yǎng)體系中賴氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸和苯丙氨酸濃度對(duì)αs-酪蛋白合成的影響。采用貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)奶牛乳腺組織,分別調(diào)整培養(yǎng)體系中賴氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)、蘇氨酸(Thr)和苯丙氨酸(Phe)濃度,研究其對(duì)αs-酪蛋白合成的

4、影響?；A(chǔ)培養(yǎng)液中Lys、Met、Thr、Phe、Val、Leu、Ile濃度均分別為120、60、103、105、154、214、120μg/ml,Lys濃度分別為120、145、170、195、220、245、270μg/ml,Met濃度分別為50、60、70、80、90、100、110μg/ml,Thr濃度分別為73、88、103、118、133、148、163μg/ml,Phe濃度分別為75、90、105、120、135、150、

5、165μg/ml。結(jié)果顯示,當(dāng)Lys、Met、Thr和Phe濃度分別為195μg/ml、80─100μg/ml、118-133μg/ml和135-165μg/ml時(shí),乳腺αs-酪蛋白合成量顯著高于其他濃度組(P＜0.01)。通過(guò)擬合曲線估算αs-酪蛋白合成量最大時(shí)的Lys、Met、Thr和Phe的濃度分別為203、81、118和137μg/ml。
　　 試驗(yàn)三、蛋氨酸及其二肽(Met-Met)不同組合對(duì)αs-酪蛋白合成的影響。試

6、驗(yàn)共設(shè)5個(gè)組,各組的蛋氨酸濃度分別為50、67.5、85、102.5、120μg/ml,蛋氨酸二肽濃度分別為70、52.5、35、17.5、0μg/ml。試驗(yàn)結(jié)果表明,Met為85μg/ml、Met-Met為35μg/ml的組合(即中間組),其αs-酪蛋白合成量最高,且顯著高于其他各組(P＜0.01)。通過(guò)擬合曲線計(jì)算Met濃度為81μg/ml、Met-Met濃度為38μg/ml,即Met與Met-Met的比例約為2:1時(shí),αs-酪蛋白

7、合成量最高。
　　 試驗(yàn)四、不同氨基酸及二肽組合模式對(duì)αs-酪蛋白合成的影響。以乳蛋白氨基酸模式及根據(jù)Western-blotting法αs-酪蛋白基因表達(dá)所建立的不同氨基酸濃度組合為參照模式,設(shè)計(jì)3個(gè)模式,Lys:Met:Thr:Phe依次分別為100:34:56:63,100:40:58:68,100:54:62:64；在此基礎(chǔ)上分別以Met-Met按量佳比例(Met:Met-Met為2:1)部分替代各模式中Met,設(shè)計(jì)二肽

8、與氨基酸組合的3個(gè)模式,Lys:Met:Met-Met:Thr:Phe依次分別為100:22.5:11.5:56:63,100:26.5:13.5:58:68,100:34.5:17.5:62:64,以Lys濃度為200μg/ml調(diào)整各組的其他氨基酸濃度。試驗(yàn)結(jié)果表明,在以游離氨基酸進(jìn)行配比的條件下,當(dāng)Lys.Met:Thr:Phe為100:40:58:68時(shí)(即以Western-blotting法建立的氨基酸模式),其αs-酪蛋白的合

9、成量最高。在以二肽部分替代游離氨基酸的條件下,當(dāng)Lys.Met:Met-Met:Thr:Phe為100:22.5:11.5:56:63時(shí)αs-酪蛋白拘合成量最高,且高于完全以游離氨基酸配比時(shí)的αs-酪蛋白的合成量。
　　 綜上所述,貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)的乳腺組織在培養(yǎng)過(guò)程中能正常生長(zhǎng),可以用于體外培養(yǎng)研究,建立的Western-blotting方法可用于組織培養(yǎng)液中αs-酪蛋白的檢則。奶牛乳腺組織利用Lys、Met、Thr和Phe均有

10、一個(gè)最適濃度,在最適濃度下能顯著促進(jìn)αs-酪蛋白的合成。改變培養(yǎng)液中Met與Met-Met的比例能影響αs-酪蛋白的合成,當(dāng)兩者比例約為2:1時(shí),αs-酪蛋白合成量最高。改變培養(yǎng)液中Lys:Met:Thr:Phe比例能影響αs-酪蛋白的合成,當(dāng)此值為100:40:58:68時(shí)αs-酪蛋白的合成量最高；當(dāng)Lys:Met:Met.Met:Thr:Phe為100:22.5:11.5:6:63時(shí)αs-酪蛋白的合成量最高,且高于完全以游離氨基酸配