槲皮素對奶牛乳腺上皮細胞的生物學效應研究.pdf

1、本試驗使用不同濃度雌二醇、槲皮素單獨作用及共同作用于奶牛乳腺上皮細胞，對比三種處理下細胞抗氧化性及相關基因的表達水平，并通過建立H2O2誘導的氧化應激模型，進一步研究槲皮素在氧化應激下對細胞的保護功能。本試驗分為三個部分:
　　 一、雌激素對奶牛乳腺上皮細胞抗氧化性及HSP70 mRNA表達量的影響
　　 試驗分溶劑對照組(CK)和Ⅰ～Ⅴ濃度分別為0.5、1、5、10、100 nmol/L雌二醇(E2)處理組，培養(yǎng)奶牛乳

2、腺上皮細胞4h、8h和12 h后，MTT法檢測細胞存活率情況，比色法檢測細胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)，比色法和熒光定量RT-PCR法分別檢測培養(yǎng)12h各組細胞中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量及HSP70mRNA表達量，旨在篩選體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細胞雌激素較適添加濃度。結果顯示:(1)與對照組相比，Ⅰ～Ⅲ組細胞存活率升高(P＜0.05);Ⅳ～Ⅴ組細胞存活率降低且培養(yǎng)液中LDH活性顯著升高(P＜0.01)。(2)Ⅰ

3、～Ⅳ組細胞中HSP70mRNA表達量、SOD活性高于對照組(P＜0.05);Ⅴ組乳腺細胞的HSP70 mRNA表達量、SOD活性低于對照組(P＜0.05)。結論:低濃度E2能夠上調奶牛乳腺上皮細胞的存活率，誘導乳腺上皮細胞中HSP70mRNA表達，進而通過調節(jié)SOD活性發(fā)揮抗氧化作用，長期處于高濃度E2環(huán)境下，下調乳腺細胞存活率，降低抗氧化性并引起細胞損傷，5 nmol/L E2可作為體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細胞較適添加濃度。
　　

4、 二、槲皮素對奶牛乳腺上皮細胞抗氧化性及HSP70、Bcl-2/Bax mRNA表達量的影響
　　 試驗分溶劑對照組(CK)和Ⅰ～Ⅴ濃度分別為12.5、25、50、100、200μmol/L槲皮素(Que)處理組，培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細胞4h、8h和12 h后，檢測細胞存活率情況;檢測培養(yǎng)12h后丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脫氫酶(LDH)活性和Hsp70、Bcl-2/Bax mRNA的表達量的變化。結果表明

5、:與CK組相比，Ⅰ～Ⅲ組呈濃度和時間依賴性上調細胞存活率，上調SOD活性和胞內Bcl-2/Bax表達量，下調MDA合量及胞外LDH活性，Ⅴ組各檢測值則呈完全相反的變化(P＜0.05)。結論:12.5～50μmol/L皮素能夠上調奶牛乳腺上皮細胞存活率，提高抗氧化和抗凋亡的能力，發(fā)揮保護作用，100～200μmol/L槲皮素結果相反，發(fā)揮抗雌激素作用。
　　 三、槲皮素對奶牛乳腺上皮細胞雙雌激素樣作用及抗氧化應激作用的研究

6、　　 試驗分為溶劑對照組(CK)、5 nmol/L E2對照組、5 nmol/L E2分別與12.5、25、50、100、200μmol/L Que共同作用試驗組(Ⅰ～Ⅴ)，在培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細胞4h、8h、12h后檢測細胞存活率情況;檢測培養(yǎng)12h后MDA含量、SOD、LDH活性及HSP70 mRNA的表達量。H2O2損傷組:含200μmol/L H2O2的培養(yǎng)液作用乳腺上皮細胞4h后，換常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)12h; Que前保護組:含5

7、0μmol/L Que的培養(yǎng)液作用于乳腺上皮細胞12h后，換含200μmol/L H2O2的培養(yǎng)液培養(yǎng)4h; Que后保護組:含200μmol/L H2O2的培養(yǎng)液作用乳腺上皮細胞4h后換含50μmol/L Que的培養(yǎng)液培養(yǎng)12h，對各組細胞MDA、SOD、LDH進行檢測。旨在進一步研究Que對氧化應激細胞的保護作用以及其在不同E2水平對健康奶牛乳腺上皮細胞存活率、抗氧化性及HSP70 mRNA表達的影響，并篩選出在不同E2水平下槲皮