CIDEC基因對奶牛乳腺乳脂合成的調控研究.pdf

1、乳脂是牛奶的主要營養(yǎng)成分之一，能夠為人類提供營養(yǎng)和能量，因而生產(chǎn)具有足夠乳脂的優(yōu)質牛奶是健康食品的發(fā)展趨勢。但是我國牛奶中乳脂的含量普遍偏低，嚴重降低了乳制品在國內外市場的競爭力，因此提高乳產(chǎn)量及乳脂含量成為我們亟待解決的問題。
　　誘導細胞調亡的DFF45樣因子C(Cell-death-inducing DNA-fragmentation-factor-likeeffector c，CIDEC)是在脂肪細胞中大量表達的一種蛋白質

2、，具有促進能量儲備、抑制脂肪分解、誘導大脂滴形成，參與全身能量的平衡與調控的功能。泌乳奶牛乳腺是脂類合成旺盛的場所，但在泌乳奶牛乳腺中，CIDEC的表達以及其在乳脂合成中的作用還不明確。
　　為研究CIDEC的表達與乳脂合成之間的關系，本研究首先通過qRT-PCR、原位雜交、Western bolt和免疫熒光方法分別在轉錄水平和翻譯水平檢測了CIDEC在泌乳期高乳品質、泌乳期低乳品質和干奶期奶牛乳腺組織中的表達含量和表達部位變化，

3、結果顯示CIDEC在泌乳期高乳品質的乳腺組織中的表達顯著高于泌乳期低泌品質和干奶期的奶牛乳腺組織(P＜0.05)。CIDEC的表達部位主要位于泌乳乳腺的腺泡上皮細胞這一結果提示CIDEC的表達與乳腺泌乳相關。隨后通過基因過表達和干擾的方法，研究了CIDEC基因過表達和干擾后奶牛乳腺上皮細胞中甘油三酯含量的變化，并采用qRT-PCR方法檢測了奶牛乳腺上皮細胞中乳脂合成相關基因，包括脂肪酸從頭合成、去飽和酶基因（ACC、FASN、SCD）、

4、脂肪酸攝取、轉運、活化相關蛋白基因（CD36、FABP3、ACSL1、ACSS2）、TAG合成酶相關基因（GPAT、AGPAT6、DGAT1）、以及乳脂合成轉錄調控因子（PPARγ、PPARGC1A、SREBP1、INSIG1、SCAP）的表達。結果顯示CIDEC基因過表達后，奶牛乳腺上皮細胞中TAG合成量增加、脂滴體積變大、數(shù)量增多、乳脂合成相關基因mRNA表達量升高;而CIDEC基因干擾后，奶牛乳腺上皮細胞中TAG合成量減少，細胞內

5、脂滴體積變小，數(shù)量減少，乳脂合成相關基因mRNA表達量降低。這些結果表明CIDEC對奶牛乳腺中乳脂合成具有調節(jié)作用。
　　為進一步研究泌乳奶牛乳腺中調節(jié)CIDEC表達、進而調節(jié)乳脂合成的信號通路，我們在奶牛乳腺上皮細胞培養(yǎng)體系中添加8 mmol/L乙酸鈉和1 mmol/L BHBA，誘導乳腺上皮細胞中CIDEC的表達和乳脂的合成，并采用Western blot方法研究了mTOR信號通路AMPK信號通路分子的表達。結果顯示添加8 m

6、mol/L乙酸鈉和1 mmol/L BHBA能明顯上調mTOR信號通路下游分子4EBP1、p-4EBP1、P70S6K、p-P70S6K的表達;同時還可以誘導細胞中AMPKα的表達上調(P＜0.05)，降低pAMPK的表達;表明在奶牛乳腺上皮細胞中，CIDEC的表達受mTOR信號通路和AMPK信號通路的調節(jié)。
　　為進一步研究奶牛乳腺上皮細胞中CIDEC調節(jié)乳脂合成的分子機制，我們采用基因超表達和干擾的方法改變了細胞中PPA Rγ

7、的表達水平，分析了PPARγ超表達和干擾以后奶牛乳腺上皮細胞中CIDEC表達和甘油三酯含量的變化，并研究了PPARγ過表達同時干擾CIDEC后，乳腺上皮細胞中甘油三酯含量的變化。結果顯示PPARγ通過調節(jié)CIDEC的表達來調節(jié)乳腺上皮細胞中甘油三酯的合成。隨后采用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)篩選出CIDEC的啟動子核心區(qū)域在-100--40bp區(qū)段。通過軟件分析，預測該位置包含RXRα的結合位點。最后采用ChIP-PCR技術進一步確定了上游轉