Clusterin基因在奶牛乳腺炎中的作用及表達(dá)調(diào)控機(jī)制.pdf

1、奶牛乳腺炎是乳腺組織受到物理，化學(xué)，微生物等刺激引發(fā)乳腺病變，對奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失。對奶牛乳腺炎發(fā)病機(jī)理和防治技術(shù)的研究已有一個多世紀(jì)，大多是從乳腺炎表型癥狀出發(fā)，探尋一些合理的管理技術(shù)和防治手段，雖然取得一些療效，但仍未能從根本上解決奶牛乳腺炎的發(fā)生和徹底的控制。本研究擬從基因遺傳角度出發(fā)，探尋奶牛抗乳腺炎的新方法，試圖找到與奶牛乳腺炎抗性相關(guān)的基因，研究和分析某基因在奶牛乳腺炎發(fā)病中的作用及表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制。
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2、 Clusterin基因SNP檢測及其與奶牛乳腺炎的相關(guān)性分析
　　 本研究測序發(fā)現(xiàn)在CLU基因的5'調(diào)控區(qū)，編碼區(qū)，3'非翻譯區(qū)都存在SNP，通過分析不同SNP與1000多頭中國荷斯坦牛產(chǎn)奶量，乳脂率，乳蛋白率，體細(xì)胞數(shù)評分，脂蛋比，總奶量，總?cè)橹側(cè)榈鞍椎犬a(chǎn)奶性能的相關(guān)性，從多態(tài)效應(yīng)，基因替換效應(yīng)，單倍型組合效益，胎次效應(yīng)來分析和探討CLU基因與乳腺炎的相關(guān)性。根據(jù)實驗研究發(fā)現(xiàn)，CLU基因在中國荷斯坦牛群體內(nèi)的遺傳變異較低

3、，處于中度多態(tài)，突變產(chǎn)生正效應(yīng)占優(yōu)勢，產(chǎn)奶性能優(yōu)良的單倍型組合H1H4在牛群中數(shù)量不占優(yōu)勢，胎次效應(yīng)為正，但產(chǎn)奶性能提高的同時伴隨體細(xì)胞評分的上升，尤其是第四胎牛，產(chǎn)奶性能上升速率趨于平緩，但體細(xì)胞評分卻偏高。+17301T突變可作為抗奶牛乳腺炎的遺傳標(biāo)記輔助選擇指標(biāo)。
　　 2 Clusterin基因乳腺特異啟動子構(gòu)建及功能驗證
　　 本研究克隆獲得不同長度片段的CLU基因5'調(diào)控區(qū)序列，生物信息分析不同片段都含有啟動

4、子特有的TATAbox，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)和CpG島。將不同長度片段的CLU基因5'調(diào)控區(qū)序列分別導(dǎo)入PGL3-Basic熒光素酶表達(dá)栽體后轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，CLU基因5'調(diào)控區(qū)的F1啟動子活性很弱，且C-994T突變對F1啟動子影響不明顯，F(xiàn)2啟動子具有很強(qiáng)的啟動子活性。然后利用F2啟動子高活性的特點(diǎn)，分別構(gòu)建了包含不同啟動子的CLU基因表達(dá)載體pEGFP-N1-CMV-CLU,pEGFP-N1-F2-CLU和pEGFP-N1-CM

5、V-F2-CLU，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞和乳腺上皮細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)pEGFP-N1-F2-CLU和pEGFP-N1-CMV-F2-CLU都可以激發(fā)CLU基因的表達(dá)，并且在293T細(xì)胞中的活性要高。而復(fù)合啟動子表達(dá)載體pEGFP-N1-CMV-F2-CLU在293T細(xì)胞和乳腺上皮細(xì)胞中激活CLU基因表達(dá)的能力最強(qiáng)，且明顯觀察到CLU基因在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。
　　 3奶牛乳腺組織中Clusterin基因的可變剪切體鑒定及表達(dá)
　　 本研究乳

6、腺炎致病菌分離鑒定為金黃色葡萄球菌，克隆測序發(fā)現(xiàn)在乳腺炎乳腺組織中發(fā)生內(nèi)部外顯子剪切，實行可變剪切模式，形成兩種亞型X-CLU和Y-CLU。編碼區(qū)SNP導(dǎo)致高頻剪切位點(diǎn)消失和CLU基因mRNA二級結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈變化。CLU基因乳腺組織體內(nèi)表達(dá)顯示，X-CLU和Y-CLU在正常乳腺組織和乳腺炎乳腺組織中的表達(dá)量差異顯著，X-CLU在乳腺炎乳腺組織中mRNA表達(dá)量上調(diào)。在6個正常乳腺組織和6個乳腺炎乳腺組織中都出現(xiàn)了80 kDa的蛋白條帶，但

7、是在第二個正常乳腺組織和第一個乳腺炎乳腺組織中出現(xiàn)了60 kDa的蛋白條帶。構(gòu)建的CLU基因復(fù)合啟動子表達(dá)載體pEGFP-N1-CMV-F2-X-CLU和pEGFP-N1-CMV-F2-Y-CLU分別轉(zhuǎn)染乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行乳腺組織體外表達(dá)顯示只檢測到X-CLU的mRNA表達(dá)，且蛋白分子量約60 kDa，而Y-CLU沒有表達(dá)。80 kDa的蛋白可能是機(jī)體適應(yīng)某種環(huán)境伴隨X-CLU和Y-CLU兩種蛋白的相互作用而形成的蛋白復(fù)合體。
　　

8、 4 Clusterin基因3'UTR靶標(biāo)確證奶牛乳腺炎抗性相關(guān)microRNA
　　 本研究在CLU基因3'UTR區(qū)發(fā)現(xiàn)3個突變位點(diǎn)，生物信息分析發(fā)現(xiàn)+17301T缺失突變對miRNA的結(jié)合情況起關(guān)鍵作用。生產(chǎn)性能相關(guān)性研究顯示+17301T突變與乳腺炎成正相關(guān)。CLU基因3'UTR在+17301 T突變前結(jié)合bta-miR-2373，但T缺失后不結(jié)合。本研究中心基因芯片結(jié)果顯示在中國荷斯坦牛乳腺炎乳腺組織中bta-miR-

9、2373表達(dá)下調(diào)4.0倍。因此選擇bta-miR-2373作為乳腺炎相關(guān)miRNA進(jìn)行研究，實驗證明，miRNA前體表達(dá)克隆載體CCS-bta2373-MR04在293T細(xì)胞中過表達(dá)，與CLU基因3'UTR靶標(biāo)表達(dá)克隆載體pMIR-REPORT-miRNA-PT共轉(zhuǎn)后，兩者幾乎完全結(jié)合，從而抑制CLU基因表達(dá)，CCS-bta2373-MR04也可以部分結(jié)合pMIR-REPORT-miRNA-PT-SNP降低CLU基因表達(dá)。因此，在乳腺炎