奶牛乳腺炎來源的葡萄球菌甲氧西林抗性傳播的機制研究.pdf

1、葡萄球菌是導致人畜共患病的主要病原菌之一，在畜禽上可引起急性或慢性傳染病，給畜禽帶來嚴重的健康威脅，給畜禽養(yǎng)殖業(yè)造成極大的經(jīng)濟損失。近年來抗生素的過度使用催生了耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)，這類葡萄球菌外源性獲得了一種染色體盒式結(jié)構(gòu)（SCCmec）。位于SCCmec上的mecA(或者mecC)基因編碼的PBP2a蛋白參與細胞壁的合成，對內(nèi)酰胺類抗生素有很低的親和力，從而介導MRS對內(nèi)酰胺類藥物的抗性。臨床上，MRS的檢測通常是通過抗性表

2、型篩選的方法來實現(xiàn)的。
　　大量間接證據(jù)表明MRS菌株之所以大量出現(xiàn)并廣泛傳播，是因為SCCmec可以在不同菌種和不同菌株之間進行水平基因轉(zhuǎn)移。水平基因轉(zhuǎn)移是抗性傳播的主要方式，SCCmec從基因組上切除是SCCmec轉(zhuǎn)移到其他菌株的起始步驟，也是最為關(guān)鍵的一步。SCCmec的切除是由自身攜帶的編碼盒式染色體重組酶基因ccr介導的。目前為止，常用抗生素如何調(diào)控SCCmec切除和轉(zhuǎn)移的信號通路并不清楚，亟待研究。
　　近年來，

3、一種新型的MRS菌株，即表型敏感，mecA陽性的耐甲氧西林葡萄球菌(OS-MRS)不斷被報道。這類葡萄球菌含有SCCmec/mecA，卻沒有抗性表型，會被錯誤的診斷為甲氧西林敏感葡萄球菌。而OS-MRS菌株在內(nèi)酰胺類抗生素的刺激下，可以在短時間內(nèi)由敏感表型轉(zhuǎn)變?yōu)楦呖贡硇?，苯唑西林最低抑菌濃度高達128μg/mL以上。這會導致治療失敗，病情加重等情況，對人類和畜禽健康，甚至生命造成巨大威脅。因此，找到參與OS-MRS菌株表型調(diào)控和表型轉(zhuǎn)變

4、的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子就成了解決這類問題的首要任務(wù)，值得深入研究。
　　實驗一通過抗生素標準檢測方法，對采集來的244個牛生鮮乳樣品中是否殘留抗生素進行了檢測，結(jié)果顯示，超過50％的樣品含有抗生素。隨機選擇了39個含有抗生素的樣品，進一步檢測了其中5種特定抗生素（環(huán)丙沙星、氯霉素、磺胺嘧啶、鏈霉素和四環(huán)素）的具體殘留量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在選取的39個含抗生素樣品中，環(huán)丙沙星的殘留量均超過歐盟制定的最大殘留限制標準(MRLs);此外，2種、3種

5、、4種和5種抗生素在單樣品中同時超出標準(MRLs)的樣品數(shù)量分別是11個、9個、13個和2個。
　　試驗二通過多種分子生物學手段，試圖確定畜牧中廣泛使用的一些抗生素是通過何種信號通路，最終促進重組酶ccr基因的表達和SCCmec的轉(zhuǎn)移起始。從試驗結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，很多抗生素能顯著促進重組酶ccr基因的表達和SCCmec的切除，包括內(nèi)酰胺類，糖肽類，四環(huán)素類，磺胺類，喹諾酮類等抗生素。在這些抗生素中，靶向DNA的抗生素能在濃度很低的情況

6、下誘導ccr的表達。因此，推測，抗生素可能通過激活SOS修復途徑，進而上調(diào)ccr的表達。經(jīng)過體內(nèi)的敲除實驗和體外的凝膠阻滯實驗驗證，發(fā)現(xiàn)，抗生素在一定劑量下能夠引起葡萄球菌的DNA損傷，DNA的損傷激活SOS信號通路，信號通路中的重要蛋白LexA從ccr基因的啟動子上脫落下來，Ccr的表達促進SCCmec的切除。
　　試驗三研究了耐甲氧西林葡萄球菌中甲氧西林抗性表型的調(diào)控機制。使用牛奶源分離得到的葡萄球菌菌株作為實驗材料，通過基因

7、表達水平差異比較，發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)性因子BlaR1和BlaI的表達量是影響抗性表型和抗性轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵因素。在OS-MRS菌株中，BlaR1和BlaI都是高表達，在無抗生素誘導的情況下，高表達的BlaI能抑制mecA的表達，從而降低抗性表型;而在抗生素誘導的情況下，高表達的BlaR1可以通過活化解除BlaI的抑制作用，促進PBP2a在短時間內(nèi)高表達，以恢復抗性表型應(yīng)對抗生素的刺激。
　　綜上所述，實驗一的結(jié)果建議，牛生鮮乳中抗生素殘留的常規(guī)檢

8、測對于避免畜牧生產(chǎn)中抗生素的不合理使用是必要的。試驗二的結(jié)果詳細闡明了多種抗菌制劑促進葡萄球菌甲氧西林抗性傳播的機制，意義重大。在畜禽養(yǎng)殖上，甚至在人類疾病的臨床治療上，這對如何設(shè)計治療方案和所用抗生素劑量以應(yīng)對MRS感染產(chǎn)生直接影響。同時，為抗菌制劑的研發(fā)提供了新的方向，即如何以一種有效的但不會促進抗生素耐藥性擴散的思維方式去進行新藥研發(fā)。實驗三的結(jié)果提示，在對MRS，包括OS-MRS進行篩選鑒定的過程中，要把bla基因簇的影響考慮進