人溶菌酶基因治療奶牛乳腺炎的初步研究.pdf

1、根據(jù)已發(fā)表的人溶菌酶(human lysozyme,hLYZ)mRNA序列設(shè)計引物,以人乳腺第一鏈cDNA為模板,用PCR方法擴(kuò)增出1.5 kb hLYZ雙鏈cDNA,其推導(dǎo)的氨基酸序列與國外發(fā)表的從胎盤、巨噬細(xì)胞和結(jié)腸中克隆的hLYZ氨基酸序列同源性為100％,與從人組織細(xì)胞中克隆的hLYZ僅有1個氨基酸差異,但與從中國人胎盤中克隆的hLYZ具有6個氨基酸差異.將此cDNA亞克隆入真核表達(dá)載體pc DNA3和乳腺特異表達(dá)載體pCX中,

2、用所獲得的基因構(gòu)件pcDNA3LYZ轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞進(jìn)行暫態(tài)表達(dá),用免疫熒光法檢測到表達(dá)產(chǎn)物;用基因構(gòu)件pCXLYZ注射哺乳期小鼠,經(jīng)微球菌溶解試驗證明,上述基因構(gòu)件能有效地驅(qū)動目的基因在小鼠乳腺中表達(dá),表達(dá)量為69.3μg/ml.將序列正確的hLYZcDNA克隆入乳腺特異表達(dá)載體p205C3,用獲得的重組質(zhì)粒p205C3LYZ注射正常奶牛乳腺,通過微球菌球脂擴(kuò)散法檢測其乳汁中溶菌酶含量達(dá)1.18-1.96μg/ml,表達(dá)至少維持8天

3、.3次共注射600μg重組質(zhì)粒于患隱性乳腺炎的奶牛乳腺中,于注射后第2、6、10天分別采集奶樣,通過奶樣的C.M.T.變化來判斷治療效果,其有效率分別為4/14、14/14、12/14.對比治療試驗顯示,基因治療和抗菌素治療的有效率分別為86.4％(19/22)和88.9％(8/9),顯著高于中藥治療組的有效率(69.2％,9/13).治療有效的奶牛乳腺炎癥狀消失,葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌及細(xì)菌總數(shù)明顯減少,奶牛日均產(chǎn)奶量顯著增高.用