過表達Six1對鴨成肌細胞蛋白質(zhì)代謝相關(guān)基因表達的影響及調(diào)控途徑初探.pdf

1、Six1是SIX轉(zhuǎn)錄因子家族(Sine oculis homeobox family，SIX)中重要的成員，在肌肉發(fā)生、生肌節(jié)形成及肌纖維類型分化等過程中起著重要作用。另外，Six1與其協(xié)同因子Eya2能直接上調(diào)mTOR的表達，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成代謝增強，引起心肌生理性肥大，表明Six1在肌肉蛋白質(zhì)合成代謝過程中也發(fā)揮著重要的作用。但目前關(guān)于Six1與肌肉蛋白質(zhì)代謝的具體調(diào)控機制還未見報道。本研究通過鴨成肌細胞轉(zhuǎn)染真核表達載體pEGFP-

2、duSix1，分析過表達Six1基因?qū)毎鲋郴钚约凹毎鞍踪|(zhì)代謝的影響。同時為深入探討Six1是否對蛋白質(zhì)合成的相關(guān)基因PI3K、mTOR具有調(diào)控作用，采用其特異性抑制劑LY294002、雷帕霉素處理鴨成肌細胞，再過表達Six1基因，探討Six1基因在細胞蛋白代謝過程中可能存在的具體調(diào)控途徑。結(jié)果表明:
　　1、利用真核表達載體pEGFP-duSix1轉(zhuǎn)染鴨成肌細胞，發(fā)現(xiàn)Six1基因的mRNA表達量極顯著高于對照組(P＜0.01

3、)，細胞增殖活性明顯上升(P＜0.05)，同時mTOR、S6K1的mRNA表達水平顯著上調(diào)(P＜0.05)。Western-blot結(jié)果也表明過表達Six1能上調(diào)S6K1的蛋白表達量，表明過表達Six1基因?qū)毎麅?nèi)的蛋白質(zhì)合成代謝具有明顯的促進作用，同時Six1對于PI3K/Akt/mTOR信號通路存在重要調(diào)控作用。
　　2、pEGFP-duSix1轉(zhuǎn)染鴨成肌細胞，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組FOXO1、MAFbx、MuRF1的mRNA表達量相對對

4、照組也有不明顯的上升趨勢(P＞0.05)，Western-blot結(jié)果也顯示p-FOXO1的蛋白表達量上升，推測過表達Six1基因也可能影響細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的降解代謝途徑，但需要進一步的研究證實。
　　3、利用PI3K、mTOR特異性抑制劑LY294002、Rapamycin處理鴨成肌細胞，發(fā)現(xiàn)細胞增殖活性均明顯降低(P＜0.05)，并且隨著處理時間延長和抑制劑濃度增加，抑制效果越明顯;其中，LY294002抑制劑處理細胞后，通過熒光

5、定量PCR檢測蛋白合成代謝信號通路相關(guān)基因的mRNA表達量，發(fā)現(xiàn)PI3K、Akt、mTOR表達量顯著下降(P＜0.05);而在Rapamycin處理實驗組中，發(fā)現(xiàn)僅mTOR的表達量明顯下調(diào)(P＜0.05)，PI3K、Akt的表達量并沒有明顯下調(diào)。Western-blot結(jié)果顯示S6K1的蛋白表達量下降，表明兩種抑制劑對于細胞蛋白質(zhì)合成均具有明顯的抑制作用;同時我們發(fā)現(xiàn)與蛋白降解的相關(guān)基因FOXO1、MAFbx、MuRF1的mRNA表達量

6、卻沒有明顯的變化。
　　4、過表達Six1基因可明顯緩解LY294002及Rapamycin處理所引起的細胞蛋白合成代謝的抑制作用，能明顯上調(diào)鴨成肌細胞的增殖活性(P＜0.05)，同時mTOR、S6K1的mRNA表達量也都顯著上調(diào)(P＜0.05)，另外，S6K1的蛋白表達量也呈現(xiàn)上調(diào)趨勢。但是在兩種抑制劑處理后過表達Six1導(dǎo)致蛋白降解相關(guān)基因FOXO1、MAFbx、MuRF1的mRNA表達量表現(xiàn)出不同的變化趨勢。
　　5、