攜人IGF-1基因成肌細(xì)胞在體存活、產(chǎn)物表達(dá)及對(duì)內(nèi)源性IGF-1表達(dá)的影響.pdf

1、骨骼肌損傷是運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)中常見(jiàn)的損傷之一，問(wèn)題是骨骼肌損傷后再生能力有限，結(jié)構(gòu)及功能恢復(fù)常常不完全，愈合緩慢，并伴有一定程度的纖維化，易發(fā)生再損傷。研究發(fā)現(xiàn)，胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)是肌肉．再生過(guò)程中的重要因子，可促進(jìn)體外培養(yǎng)的成肌細(xì)胞增殖和分化，局部注射外源性IGF—l可以加速損傷骨骼肌愈合。 在我們前期研究生的實(shí)驗(yàn)中，已經(jīng)成功構(gòu)建了攜hlGF-1基因的真核高表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3．1-hlGF．1，并在體外轉(zhuǎn)染C2C12成肌細(xì)胞

2、，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)4周后仍可有hlGF．1的表達(dá)，且具有良好的生物活性。隨后，我們將攜hlGF-1基因的成肌細(xì)胞植入損傷小鼠骨骼肌局部，發(fā)現(xiàn)可促進(jìn)損傷后骨骼肌愈合標(biāo)志產(chǎn)物MHC—IIb的mRNA及蛋白表達(dá)，并一定程度地抑制骨骼肌釬維化標(biāo)志產(chǎn)物vimentin的mRNA及蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)骨骼肌愈合、抑制纖維化。 而攜hlGF-1基因的成肌細(xì)胞在移植入小鼠體內(nèi)后能否存活，骨骼肌損傷局部微環(huán)境是否影響轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的存活，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在

3、體存活壽命是否足以滿足促進(jìn)骨骼肌損傷的進(jìn)程，是本研究擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題。鑒于已有研究證明外源性IGF一1可以促進(jìn)內(nèi)源性IGF-1的表達(dá)，我們假設(shè)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的產(chǎn)物表達(dá)，同樣可以促進(jìn)鼠tGF-1的表達(dá)，進(jìn)而從一個(gè)側(cè)面闡述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞促進(jìn)骨骼肌損傷愈合的作用機(jī)制。 本實(shí)驗(yàn)第一部分研究攜hlGF一1基因的成肌細(xì)胞移植小鼠骨骼肌局部后的存活及轉(zhuǎn)歸、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞移植后的hlGF一1基因表達(dá)情況。將BrdU標(biāo)記于移植前細(xì)胞，植入小鼠體內(nèi)后，采用免疫

4、組織化學(xué)方法證實(shí)移植細(xì)胞至少可存活30天。分別從mRNA水平和蛋白水平用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法和免疫組織化學(xué)方法證實(shí)hIGF．1在C3H小鼠中可長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)。 本實(shí)驗(yàn)第二部分研究攜htGF-1基因的成肌細(xì)胞移植小鼠骨骼肌局部后對(duì)于內(nèi)源性IGF-l表達(dá)的影響，來(lái)探討攜hlGF-1基因的成肌細(xì)胞促進(jìn)骨骼肌損傷修復(fù)的機(jī)理。分別從mRNA水平和蛋白水平用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法和免疫組織化學(xué)方法證實(shí)hlGF-1基因的成肌細(xì)胞移植小鼠骨骼肌

5、局部后可促進(jìn)內(nèi)源性鼠IGF-1因子的表達(dá)，從而進(jìn)一步促進(jìn)損傷骨骼肌的愈合。 第一部分 攜人IGF一1基因的成肌細(xì)胞在小鼠體內(nèi)存活及產(chǎn)物表達(dá)情況研究 目的：研究攜hlGF一1基因的成肌細(xì)胞移植小鼠體內(nèi)后的存活及轉(zhuǎn)歸，以及移植后hlGF—l基因的表達(dá) 方法：雄性C3H小鼠共80只(20—30g，7一11w)隨機(jī)分為A組(正常小鼠轉(zhuǎn)基因細(xì)胞移植組)、B組(正常小鼠空白成肌細(xì)胞移植組)、C組(受傷小鼠轉(zhuǎn)基因細(xì)胞移

6、植組)、D組(受傷小鼠空白成肌細(xì)胞移植組)四組，A、B兩組分別于右側(cè)腓腸肌中段注射轉(zhuǎn)基因成肌細(xì)胞或空白成肌細(xì)胞，C、D兩組以重力打擊造成小鼠右側(cè)腓腸肌中段頓挫傷，傷后第3天分別于致傷局部注射轉(zhuǎn)基因成肌細(xì)胞或空白成肌細(xì)胞。注射細(xì)胞后2、5、10、20、30于各組由隨：幾抽取4只小鼠處死，取右側(cè)腓腸肌中段進(jìn)行檢測(cè)，行BrdU免疫組化染色，檢測(cè)外源細(xì)胞在體內(nèi)的存活情況；A、B、C、D四組另行hlGF—I免疫組化染色及卜IGF—ImRNA熒光定

7、量實(shí)時(shí)PCR，檢測(cè)外源轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在體內(nèi)表達(dá)hlGF一1情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用SPSS10．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P<0．05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 ．結(jié)果：①各組小鼠均有BrdU免疫組化陽(yáng)性染色；②A、C兩組均有hlGF一1mRNA表達(dá)、hlGF—l免疫組化染色陽(yáng)性，B、D兩組未檢則到hlGF-1mRNA表達(dá)、hlGF一1免疫組化染色陰性。 結(jié)論：攜hlGF一1基因的成肌細(xì)胞移植入正常及鈍挫傷的小鼠體內(nèi)后，可存活一段時(shí)間，并

8、能穩(wěn)定地分泌hlGF一1因子。 第二部分 攜人IGF一1基因的成肌細(xì)胞對(duì)損傷小鼠內(nèi)源性mIGF一1表達(dá)的影響 目的：研究攜人胰島素樣生長(zhǎng)因子一1(humaninsulin一1ikegrowthfactor一1，hlGF一1)基因的成肌細(xì)胞移植損傷小鼠體內(nèi)后，mlGF—lmRNA及mIGF—l因子的表達(dá)情況。 方法：雄性CsH小鼠(20—30g，7一11w)共72只，分為A組(轉(zhuǎn)基因成肌細(xì)胞移植組)、B組(

9、空白成肌細(xì)胞移植組)、C組(生理鹽水對(duì)照組)3組，于右下肢腓腸肌內(nèi)側(cè)面中段實(shí)施鈍性打擊，打擊傷后第3天分別于致傷部位注入l×106個(gè)轉(zhuǎn)基因成肌細(xì)胞、等量的空白成肌細(xì)胞或lOOul生理鹽水；打擊傷后2、5、10、15、20、30天，于各組中隨機(jī)抽取4只小鼠處死，取右側(cè)腓腸肌中段進(jìn)行檢測(cè)，以實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫組化染色檢測(cè)小鼠mlGF一1的表達(dá)，4只小鼠做正常對(duì)照。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS10．0統(tǒng)計(jì)軟件，采取One—WayANOVA方法