IGF-1促進人NK細胞發(fā)育及殺傷功能.pdf

1、自然殺傷細胞(Natural killer cells，NK cells)，作為與T細胞、B細胞并列的一大類淋巴細胞群體，是天然免疫系統(tǒng)的重要成員。NK細胞除了參與先天性免疫應答之外，還在適應性免疫的免疫調節(jié)中起著重要的調控作用。研究表明，NK細胞在病原微生物感染、腫瘤以及自身免疫病等多種病理過程中都發(fā)揮著重要的功能。然而，NK細胞的發(fā)育、分化以及功能的調節(jié)等研究領域還存在許多空白。因此，深入研究NK細胞發(fā)育及其功能的調控機制將具有重要

2、的意義。
　　 胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)，其生物學功能非常廣泛，已經有文獻報道IGF-1可以促進T、B細胞的發(fā)育和生物學功能;但IGF-1在NK細胞發(fā)育及功能中有何作用卻鮮有報道。本課題主要研究IGF-1在人NK細胞發(fā)育及功能中的調控作用，并深入探討其機制，進一步完善人NK細胞的基礎生物學理論，并為NK細胞的臨床生物治療提供堅實的實驗基礎。
　　 本課題

3、首先分離正常的新生兒臍帶血來源的CD34+造血干細胞(hematopoietic stem cells，HSC)，加入干細胞因子(stem cell factor，SCF)、Flt3配體(fms-like tyrosine kinase-3 ligand，Flt3L)和白介素-15(interleukin-15，IL-15)進行長期培養(yǎng)（28天），進行體外NK細胞的分化及擴增，通過在該體系中加入IGF-1，探討IGF-1對人NK細胞的發(fā)

4、育及功能的影響及相關分子機制;其次分離正常人早孕蛻膜NK細胞，體外用IGF-1刺激，進一步闡明IGF-1對人NK細胞功能的影響及分子機制;此外，我們在實驗中發(fā)現不同來源的NK細胞分泌不同水平的IGF-1，因此，利用IGF-1 siRNA及中和抗體阻斷實驗闡明內源性IGF-1對NK細胞功能的影響;為了揭示不同來源NK細胞差異表達內源性IGF-1的分子機制，我們利用microRNA芯片技術比較不同來源的NK細胞micmRNA表達譜差異，以篩

5、選調控NK細胞內源性IGF-1表達的microRNA，并驗證目的microRNA通過靶向IGF-1調控NK細胞的功能。
　　 一、 IGF-1促進人NK細胞發(fā)育。
　　 我們應用體外人NK細胞誘導分化體系，即體外分離純化新生兒臍帶血來源的CD34+造血干細胞，采用SCF、Flt3L、IL-15聯(lián)合細胞因子刺激CD34+HSC分化發(fā)育為NK細胞。通過在該體系中加入IGF-1，培養(yǎng)28天后收集細胞，計數，進一步采用流式細胞術

6、檢測CD3℃D56+NK細胞的比例、表面受體分子的表達及其功能性指標的表達變化，明確IGF-1在人NK細胞的發(fā)育及功能中的作用;通過檢測NK細胞發(fā)育過程中IRS-1的表達水平，初步闡明IGF-1促進NK細胞發(fā)育的機制。
　　 結果顯示，當在該體系中加入IGF-1后，NK細胞的比例和絕對數都有顯著提高;流式細胞術檢測結果發(fā)現加入IGF-1組發(fā)育分化的NK細胞殺傷相關分子如穿孔素的表達上調，脫顆粒的能力上調（CD107a表達上調）。

7、
　　 此外，我們發(fā)現在體外NK細胞發(fā)育過程的第14天，即NK細胞前體出現的時間，細胞不表達IRS-1，而在發(fā)育過程的第21天，細胞則表達IRS-1。鑒于IRS-1在IGF-1信號傳遞中的作用，我們得出以下結論:在IGF-1促進NK細胞發(fā)育的過程中，IGF-1可能起雙重作用，即IGF-1先促進NK細胞前體的分化，之后則促進分化后NK細胞的增殖。
　　 綜上結果，我們得出如下結論:IGF-1可以促進人NK細胞發(fā)育，且有可能

8、提高NK細胞的殺傷潛能。
　　 二、 IGF-1促進入NK細胞殺傷功能。
　　 為了進一步驗證IGF-1對人NK細胞殺傷功能的影響，我們首先收集正常人早孕蛻膜組織，分離純化蛻膜NK細胞，體外用IGF-1刺激培養(yǎng)24 h，通過流式細胞術檢測NK細胞穿孔素perforin及CD107a的表達;51Cr釋放實驗檢測NK細胞的細胞毒活性（殺傷功能）的變化。同時，我們對IGF-1刺激NK細胞后胞內信號分子進行了初步檢測，以進一步闡

9、明IGF-1促進人NK細胞殺傷功能的相關分子機制。
　　 流式細胞術檢測結果顯示，當IGF-1刺激早孕蛻膜NK細胞后，NK細胞perforin及CD107a表達均顯著上調，51Cr釋放實驗結果顯示，IGF-1刺激蛻膜NK細胞后其細胞毒活性（殺傷功能）也有顯著提高。
　　 此外，我們發(fā)現IGF-1可以促進NK細胞中STAT3的磷酸化，而且STAT3的抑制劑在抑制STAT3活化的同時，也抑制了NK細胞perforin的表達，

10、這表明IGF-1促進NK細胞殺傷功能的機制，可能是通過STAT3信號途徑啟動了perforin的表達，進而發(fā)揮其更強的細胞毒活性。
　　 根據這部分結果我們得出如下結論:IGF-1可以促進人NK細胞的殺傷功能。
　　 三、內源性IGF-1對NK細胞的殺傷功能至關重要。
　　 在實驗過程中，我們發(fā)現不同來源的NK細胞，如正常人外周血NK(pNK)細胞及早孕蛻膜組織中的NK(dNK)細胞均可分泌IGF-1，且分泌水平

11、存在差異。鑒于不同來源的NK細胞其殺傷功能存在差異，因此我們推測內源性IGF-1可能參與NK細胞殺傷功能的調控。為了進一步驗證內源性IGF-1在人NK細胞殺傷功能中的重要調控作用，我們利用核轉染技術將IGF-1 siRNA轉染NK細胞系，qRT-PCR檢測perforin等殺傷相關基因的表達變化;利用IGF-1中和抗體處理人外周血NK細胞，51Cr釋放實驗檢測NK細胞殺傷功能的變化。
　　 結果顯示，當IGF-1 siRNA轉染

12、NK細胞系后，NK細胞perforin表達下調;51Cr釋放實驗結果顯示:當IGF-1中和抗體處理外周血NK細胞后，NK細胞的殺傷功能顯著降低。此外，我們發(fā)現臨床上反復流產病人的早孕蛻膜NK(dNK)細胞較正常人早孕蛻膜NK(dNK)細胞表達較高的內源性IGF-1，這與它們的殺傷能力呈正相關趨勢。
　　 綜上結果我們得出如下結論:內源性IGF-1對NK細胞的殺傷功能至關重要。
　　 四、 miR-483-3p靶向IGF-

13、1調控人NK細胞的殺傷功能。
　　 為了揭示不同來源NK細胞差異表達內源性IGF-1的分子機制，我們采用microRNA芯片技術，比較不同來源的NK細胞(dNK，cNK，pNK)以及外周血來源的NKT和T細胞之間microRNA的表達譜差異;利用靶基因預測網站分析與IGF-1相互作用的microRNA;利用分子克隆方法構建IGF-13UTR雙熒光素酶報告載體并鑒定，之后進行雙熒光素酶報告基因檢測方法驗證microRNA與靶基因相

14、互作用;利用microRNA模擬體mimic和抑制劑inhibitor，并結合IGF-1中和抗體闡明microRNA通過靶向IGF-1調控人NK細胞的殺傷功能。
　　 microRNA芯片檢測結果顯示，不同來源的人NK細胞其microRNA表達譜有著顯著的差異;此外我們篩選到7個在NK細胞中特異表達的microRNAs:miR-340*,miR-483-3p,miR-130a, miR-199b-5p,miR-199a-3p,m

15、iR-210和miR-362-5p。其中miR-483-3p在早孕蛻膜NK(decidual NK，dNK)細胞中特異性高表達，利用Targetscan等預測網站分析發(fā)現IGF-1為其潛在相互作用的靶基因;接下來，我們成功構建了分別包含IGF-1野生型3'UTR及突變型3'UTR的雙熒光素酶報告基因載體，并采用雙熒光素酶報告基因實驗，驗證miR-483-3p可與預測靶基因IGF-1相互作用。我們迸一步采用miR-483-3p mimic

16、核轉染NK細胞，上調NK細胞中miR-483-3p的表達，結果發(fā)現NK細胞殺傷能力減弱;相反，用miR-483-3p inhibitor核轉染dNK細胞，下調dNK細胞中hsa-miR-483-3p的表達后，結果發(fā)現dNK細胞殺傷能力顯著增強，并且IGF-1中和抗體可以逆轉miR-483-3p inhibitor對NK殺傷功能的影響。這表明miR-483-3p通過直接靶向NK細胞內源性IGF-1的表達，進而抑制NK細胞的殺傷功能。

17、>　　 綜合以上，本課題的研究發(fā)現了生長因子IGF-1在人NK細胞中的新功能，即IGF-1可以促進人NK細胞的發(fā)育和細胞毒活性（殺傷功能），并深入闡述了其中的詳細機制。此外，我們發(fā)現NK細胞的內源性IGF-1的表達對NK細胞的殺傷功能至關重要;不同來源的NK細胞殺傷功能的差異可能來自于其內源性IGF-1的差異表達，NK細胞IGF-1的差異表達受miR-483-3p的調控，即miR-483-3p可以通過靶向IGF-1調控NK細胞的殺傷功