甘草甜素增強(qiáng)NK92-MI細(xì)胞殺傷功能機(jī)制的研究.pdf

1、前言:
　　 甘草甜素(G1ycyrrhizin,GL)是甘草中三萜皂甙的主要成分,具有抗病毒、抗炎、抗過敏、抗變態(tài)反應(yīng)、抗腫瘤等作用,國內(nèi)外的研究已證明它對機(jī)體免疫系統(tǒng)功能產(chǎn)生一定的調(diào)節(jié)作用。甘草甜素具有廣泛藥理作用,其免疫調(diào)節(jié)作用表現(xiàn)在對免疫活性細(xì)胞、細(xì)胞因子、補(bǔ)體等的促進(jìn)作用。故臨床上已廣泛應(yīng)用于急性、慢性肝炎、濕疹、蕁麻疹及過敏性皮膚病、藥物疹和嗜酸性粒細(xì)胞增多癥以及AIDS等疾病的治療。
　　 自然殺傷細(xì)胞(n

2、aturalkiller,NK)來源于骨髓淋巴樣干細(xì)胞,主要分布于外周血和脾臟。NK細(xì)胞不表達(dá)特異性抗原識別受體,是不同于T,B淋巴細(xì)胞的第三類淋巴細(xì)胞。NK細(xì)胞無需特異性抗原識別便可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞和病毒感染的細(xì)胞。NK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞主要是通過與靶細(xì)胞直接接觸,分泌殺傷介質(zhì)穿孔素、顆粒酶、TNF和NK細(xì)胞毒因子(LT)等導(dǎo)致靶細(xì)胞死亡。另一方面,NK細(xì)胞還可通過分泌IFN-γ、INF-α、GM-CSF、LT、IL-8和IL-5等有免

3、疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子途徑來間接殺傷靶細(xì)胞。
　　 目前,已有一些研究表明GL對機(jī)體免疫功能具有調(diào)節(jié)作用,但其作用機(jī)制尚不十分清楚。鑒于甘草甜素和NK細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中的重要地位,本研究以NK-92MI細(xì)胞株為研究體系,首先研究了GL對NK-92MI細(xì)胞增殖活性和殺傷活性等功能的影響,并分析了殺傷介質(zhì)(穿孔素和顆粒酶B)的釋放與GL增強(qiáng)NK92-MI細(xì)胞殺傷活性的關(guān)系;其次研究了IFN-γ的釋放及IFN-γ和IP-10的tuRNA的

4、表達(dá),以揭示GL對NK細(xì)胞生物學(xué)活性調(diào)控作用的機(jī)制;最后研究了GL對NK92-MI細(xì)胞活化性受體NCRs表達(dá)的影響,以及活化性受體與抑制性受體的之間的平衡,進(jìn)一步闡明GL對NK-92MI細(xì)胞功能的調(diào)控作用及內(nèi)在作用機(jī)制。
　　 材料和方法:
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)
　　 NK細(xì)胞株:NK一92MI細(xì)胞株為非IL-2依賴性NK-92MI細(xì)胞株(NK-92MI細(xì)胞來自一個進(jìn)行性非霍奇金淋巴瘤患者,1998年建系),購自中

5、科院上海細(xì)胞庫;用含12.5%胎牛血清和12.5%馬血清的α-MEM培養(yǎng)基(不含RNA和DNA)傳代培養(yǎng)。
　　 K562細(xì)胞株:K562細(xì)胞用含12.5%胎牛血清的1640培養(yǎng)基(不含RNA和DNA)傳代培養(yǎng)。
　　 2.CCK-8法測定GL對NK-92MI細(xì)胞增殖活性的影響。
　　 3.CCK-8法測定GL對NK-92MI細(xì)胞殺傷活性的影響。
　　 4.Western-Blot法測定GL對NK-92M

6、I細(xì)胞殺傷介質(zhì)(穿孔素和顆粒酶B)蛋白表達(dá)的影響。
　　 5.ELISA法測定GL對NK-92MI細(xì)胞分泌IFN-Y量的影響。
　　 6.Real-TimePCR法測定GL對NK-92MI細(xì)胞IP-10和IFN-γmRNA表達(dá)的影響。
　　 7.Real-TimePCR法測定NCRs(NKp46、NKp44和NKp30)mRNA表達(dá)的影響。
　　 8.流式細(xì)胞術(shù)檢測傳遞抑制信號和活化信號的重要受體(NKG

7、2A/NKG2D)膜表達(dá)的影響。
　　 9.統(tǒng)計學(xué)分析
　　 所得實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±SD)表示,各組間均數(shù)比較采用一維方差分析(one-wayANOVA),p＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 實驗結(jié)果:
　　 一、GL對NK-92MI細(xì)胞增殖作用的影響
　　 一定濃度(25μg/ml～0.39μg/m1)的GL作用24h后,6.25μg/ml～0.39μg/ml的GL對NK-92M

8、I細(xì)胞的增殖有明顯促進(jìn)作用,而25μg/ml的GL對NK92-MI細(xì)胞有明顯的抑制作用。
　　 二、GL對NK-92MI細(xì)胞殺傷活性的影響
　　 一定濃度(25μg/ml～0.39μg/ml)的GL作用24h后,各濃度GL對NK-92MI細(xì)胞的殺傷活性均顯示有明顯增強(qiáng)作用。
　　 三、GL對NK-92MI細(xì)胞穿孔素和顆粒酶B蛋白表達(dá)的影響
　　 選擇對殺傷活性增強(qiáng)作用較大的濃度(25μg/ml～0.39μ

9、g/ml)的GL作用NK-92MI細(xì)胞24h,0.39μg/ml～0.78μg/mlGL可明顯增加HNK-92MI細(xì)胞穿孔素和顆粒酶B的蛋白表達(dá),6.25μg/ml～25μg/mlGL可明顯抑制NK-92MI細(xì)胞穿孔素的蛋白表達(dá)。
　　 四、GL對NK-92MI細(xì)胞IFN-γ釋放量的影響
　　 選擇對殺傷活性增強(qiáng)作用較大的濃度(25μg/ml～0.39μg/ml)的GL作用NK-92MI細(xì)胞72h,結(jié)果顯示在濃度為6.2

10、5μg/ml～0.39μg/ml的GL作用下NK細(xì)胞對IFN-γ的釋放明顯增加,而當(dāng)濃度為25μg/ml的GL則可明顯抑制IFN-γ的釋放。
　　 五、GL對NK-92MI細(xì)胞IP-10和IFN-γmRNA表達(dá)的影響
　　 選擇對殺傷活性增強(qiáng)作用較大的濃度(1.56μg/ml～0.39μg/ml)的GL作用NK-92MI細(xì)胞12h,結(jié)果顯示在濃度為0.78μg/ml的GL作用下IP-10和IFN-γmRNA表達(dá)明顯增加。

11、
　　 六、GL對NK-92MI細(xì)胞活化性受體NCRs(NKp44、NKp46、NKp30)mRNA表達(dá)的影響。
　　 選擇對殺傷活性增強(qiáng)作用較大的濃度(6.25μg/ml～0.39μg/ml)的GL作用NK-92MI細(xì)胞24h,結(jié)果證實當(dāng)濃度為0.39μg/mlGL可顯著增加NKp30,NKp44,NKp46mRNA的表達(dá),濃度為0.78μg/ml～6.25μg/ml的GL顯著抑制NKp30和NKp44mRNA的表達(dá)。

12、
　　 七、GL對NK92-MI細(xì)胞NKG2MG2D膜表達(dá)的影響
　　 選擇對殺傷活性增強(qiáng)作用較大的濃度(1.56μg/ml～0.39μg/ml)的GL作用NK-92MI細(xì)胞24h,結(jié)果顯示在濃度為1.56μg/ml和0.78μg/ml的GL作用下NKG2A/NKG2D的膜表達(dá)明顯增加。
　　 結(jié)論:
　　 1.一定濃度范圍(6.25μg/ml～0.39μg/ml)的甘草甜素對NK-92MI細(xì)胞的增殖活性

13、有促進(jìn)作用。
　　 2.一定濃度范圍(25μg/ml～0.39μg/ml)的甘草甜素對NK-92MI細(xì)胞殺傷活性有促進(jìn)作用。
　　 3.濃度為0.39μg/ml～10.78μg/ml的GL可增加NK-92MI細(xì)胞殺傷介質(zhì)(穿孔素和顆粒酶B)的蛋白表達(dá),說明GL對NK-92MI細(xì)胞殺傷活性的增強(qiáng)作用,是通過增加其殺傷介質(zhì)(穿孔素和顆粒酶B)的合成來實現(xiàn)的。
　　 4.濃度為6.25μg/ml～0.39μg/ml的G

14、L可誘導(dǎo)NK-92MI細(xì)胞中IFN-γ的釋放增加,濃度為0.78μg/ml的GL可以明顯上調(diào)NK-92MI細(xì)胞的IP-10和IFN-γmRNA的表達(dá),說明GL是通過在局部上調(diào)IP-10mRNA的表達(dá)水平來激活具有IP-10受體的自然殺傷細(xì)胞,使自然殺傷細(xì)胞釋放大量IFN-γ,進(jìn)而發(fā)揮NK細(xì)胞的殺傷作用。
　　 5.濃度為0.39μg/ml的GL可誘導(dǎo)NK-92MI細(xì)胞中NCRs(尤其是NKp46)mRNA的表達(dá)明顯增加。濃度為1