攜帶NKG2D配體和Herceptin的腺病毒聯(lián)合NK-92細胞殺傷腫瘤作用的研究.pdf

1、自然殺傷細胞（natural killer cells, NK cells）是天然免疫系統(tǒng)的一個重要組成部分，在機體抵抗病毒感染和抗腫瘤的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，不需要預先的致敏便能殺傷發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化和感染的細胞，而不損傷正常細胞。主要分布于脾臟、骨髓、淋巴結(jié)和外周血等處，可在各種趨化因子的誘導下，向炎癥等部位遷移。NK細胞表面存在多種抑制型和激活型的受體，各種信號通過這些受體的傳遞，實現(xiàn)NK細胞的抑制或激活。NK-92細胞是從一個非霍奇金淋

2、巴瘤患者體內(nèi)分離建立的一種NK細胞系，容易在體外進行大規(guī)模的擴增，克服了NK細胞分離和培養(yǎng)的諸多不便，被廣泛地應用于免疫治療研究。
　　 NKG2D是一個多亞基的細胞表面受體復合物，屬于C型凝集素樣受體家族中的一員，表達于αβ CD8T細胞、γδ T細胞和NK細胞等免疫細胞的表面，是NK細胞的一種重要的激活型受體，能與多種不同的配體分子相作用而激活NK細胞。主要組織相容性復合體I類相關(guān)分子A(Major Histocompati

3、bility Complex class I related Chain A， MICA)是NKG2D的主要配體，由383個氨基酸組成，具有3個胞外結(jié)構(gòu)域（a1、a2和a3）、一個跨膜結(jié)構(gòu)域和一個胞質(zhì)尾區(qū)。在正常情況下，只在成纖維細胞、胃腸上皮細胞和內(nèi)皮細胞等處表達，但在多種腫瘤細胞表面均存在表達上調(diào)的現(xiàn)象，NK細胞對這類細胞具有更高的殺傷活性。
　　 Herceptin是獲美國FDA許可的用于治療Her-2過表達乳腺癌患者的一

4、種重組的人源化單克隆抗體，能特異地與靶細胞表面的Her-2受體相結(jié)合，抑制Her-2過表達腫瘤的生長，通過與化療治療的聯(lián)合用藥，雖取得了一定的療效，但治愈率低，仍待進一步的改進。
　　 為獲得更好的抗腫瘤效果，本研究欲整合Herceptin靶向地結(jié)合作用于Her-2陽性腫瘤細胞和MICA特異地活化NK細胞的功能，構(gòu)建具有雙重功能的Herceptin與MICA的融合蛋白，通過融合蛋白的抗體部分與Her-2陽性的腫瘤細胞相結(jié)合，再通

5、過MICA部分與NK細胞結(jié)合，在增強NK細胞殺傷活性的同時，還能使NK細胞更多地聚集在靶細胞的周圍，對靶細胞進行更有效地殺傷。
　　 本文先是通過Overlap-PCR的方法構(gòu)建了Herceptin全長抗體基因與MICA的胞外結(jié)構(gòu)域部分基因的融合基因--Herceptin-MICA(E)，再將該融合基因重組進-5型腺病毒，并用該重組腺病毒感染293細胞而獲得所需的融合蛋白，通過ELISA和Western blot的方法檢測融合蛋

6、白在上清中的表達情況，并用間接免疫熒光分析( Indirect immunofluorescenceAssay, IFA)檢測蛋白與細胞表面Her-2受體的結(jié)合特性，最后用乳酸脫氫酶釋放實驗，研究該融合蛋白對于NK細胞殺傷SK-OV-3細胞（一種Her-2陽性的卵巢癌細胞株）的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組腺病毒Ad5-Herceptin-MICA(E)在體外能夠順利表達預期大小分子量的融合蛋白Herceptin-MICA(E)，同時，在感染48

7、h后的細胞上清中，其表達量為(471.93±12.33)ng/ml;經(jīng)Herceptin-MICA(E)處理的SK-OV-3細胞能在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光，其熒光強度與商品化的Herceptin的相似；細胞毒活性實驗（乳酸脫氫酶釋放實驗）發(fā)現(xiàn)，在不同效靶比的實驗處理組中（1:1、3:1、10:1和30:1），與未做處理的對照組及經(jīng)Herceptin處理實驗組的SK-OV-3細胞相比，NK-92細胞對預先用Herceptin-MICA