轉(zhuǎn)染NKG2D的NK細(xì)胞系對(duì)喉腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)及機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的:喉癌是耳鼻咽喉科常見(jiàn)惡性腫瘤，手術(shù)治療作為一種常用治療手段已有一百多年歷史，隨著頭頸外科的發(fā)展，喉外科手術(shù)不斷完善，喉癌患者的5年生存率及生存質(zhì)量明顯提高：加之喉部解剖特點(diǎn)、喉癌免疫原性等其它因素的影響，喉癌被認(rèn)為是相對(duì)預(yù)后較好的惡性腫瘤。但仍有30％-40％的患者，雖經(jīng)根治手術(shù)和放化療，仍因復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移而難以救治以致死亡。當(dāng)患者手術(shù)后復(fù)發(fā)和/或出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí)，腫瘤對(duì)放化療多不敏感，導(dǎo)致預(yù)后較差。此類患者3年生存率約為10％。

2、因此，如何進(jìn)一步提高療效成為當(dāng)務(wù)之急。在分子生物學(xué)和基因工程飛速發(fā)展的推動(dòng)下，免疫治療日益受到重視，顯示出良好的應(yīng)用前景。 NK細(xì)胞是天然免疫系統(tǒng)的主要效應(yīng)細(xì)胞，具有廣泛的生物學(xué)功能，位于機(jī)體抵抗腫瘤和病毒感染的第一道防線；不需要預(yù)先刺激即可識(shí)別并殺傷腫瘤和病毒感染的細(xì)胞，同時(shí)又能通過(guò)早期分泌多種細(xì)胞因子(如IFNγ、GM-CSF和TNF-β)和趨化因子來(lái)調(diào)節(jié)獲得性免疫應(yīng)答，因此，是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁。同時(shí)，NK細(xì)胞

3、對(duì)自身免疫性疾病的調(diào)節(jié)亦引起了人們的重視。因此，盡管關(guān)于NK細(xì)胞的發(fā)育分化和識(shí)別功能的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于T細(xì)胞和B細(xì)胞，關(guān)于NK細(xì)胞功能和調(diào)節(jié)的研究仍是近年來(lái)人們的極大興趣點(diǎn)，并有了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，成為免疫學(xué)研究的一大熱點(diǎn)。 近期的研究發(fā)現(xiàn)，NK細(xì)胞表面存在識(shí)別靶細(xì)胞表面分子的活化受體和抑制性受體，NK細(xì)胞的效應(yīng)功能取決于活化信號(hào)與抑制性信號(hào)的綜合。活化受體識(shí)別經(jīng)典、非經(jīng)典的MHC I類分子或MHC I類相關(guān)分子，在NK活化的啟動(dòng)方

4、面起關(guān)鍵作用，其中尤為引人注目的是NKG2D，NKG2D的單獨(dú)活化即足以刺激NK細(xì)胞的活化，并能克服抑制性受體的強(qiáng)勢(shì)信號(hào)。NKG2D的配基為非經(jīng)典的MHC樣分子MICA(MHC class I chain-related A)、MICB(MHC class Ichain-related B)及ULBPs(UL16-binding protein)，這些分子在許多上皮及非上皮來(lái)源的腫瘤細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞和受到“應(yīng)激性刺激”的細(xì)胞均有表達(dá)或

5、上調(diào)，表達(dá)MICA和/或ULBPs的腫瘤細(xì)胞普遍對(duì)NK殺傷較為敏感，MICA(-)的腫瘤細(xì)胞可因被轉(zhuǎn)染以MICA而對(duì)NK細(xì)胞殺傷的敏感性明顯增強(qiáng)。NKG2D與其配體的交聯(lián)在腫瘤發(fā)生早期的天然免疫監(jiān)視中可以介導(dǎo)對(duì)腫瘤的直接攻擊，在腫瘤發(fā)生的中后期則是獲得性免疫系統(tǒng)的共刺激信號(hào)，提示NKG2D和MICA、ULBPs的識(shí)別和作用在抗腫瘤免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用。 NKG2D的配體MICA在多數(shù)正常細(xì)胞和組織中不表達(dá)，但可由病毒感染、細(xì)菌感染和

6、應(yīng)激刺激誘導(dǎo)表達(dá)，并在許多上皮腫瘤(如黑色素瘤、結(jié)直腸癌、乳腺癌等)均有表達(dá)。NKG2D及其配體的相互作用在腫瘤免疫監(jiān)視中起著非常重要的作用，靶細(xì)胞上NKG2D配體的表達(dá)水平幾乎決定了NKG2D的活化與否和機(jī)體NK細(xì)胞免疫應(yīng)答的強(qiáng)弱，并且可以克服主要組織相容性復(fù)合體(major histocomp-atibility complex，MHC)I類分子介導(dǎo)的抑制性信號(hào)，因此，在NK細(xì)胞活化過(guò)程中起著舉足輕重的作用。喉癌組織中MICA及UL

7、BPs表達(dá)情況目前尚未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，如果喉癌組織中存在MICA及ULBPs高表達(dá)或協(xié)同表達(dá)，則可利用NK細(xì)胞的自然殺傷效應(yīng)進(jìn)行生物治療的探討性研究。 目前世界上有六株細(xì)胞系被確認(rèn)具有典型NK細(xì)胞標(biāo)志，它們是：YT、NK-92、NKL、HANK-1、KHYG-1和NK-YS。這些細(xì)胞系的免疫表型為CD1-CD2+ CD3- CD4- CD5- CD7+ CD8- CD16- CD56+ CD57- ，具有NK活性，有/無(wú)ADC

8、C效應(yīng)。在這些細(xì)胞系中，YT細(xì)胞，來(lái)自-急性淋巴母細(xì)胞淋巴瘤和胸腺瘤患者，1985年建系，為IL-2非依賴或低依賴細(xì)胞系，具有NK細(xì)胞的典型表面標(biāo)志，但由于長(zhǎng)期在實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)，只能檢測(cè)到NKG2D的mRNA表達(dá)，而不易檢測(cè)到其蛋白的表達(dá)。YT細(xì)胞相對(duì)于NK-92和NKL細(xì)胞而言，其殺傷活性相對(duì)較地低。我們選用YT細(xì)胞作為NKG2D轉(zhuǎn)染細(xì)胞的受體，來(lái)探討NKG2D分子的作用機(jī)制。 本研究首先檢測(cè)人喉癌細(xì)胞Hep2及喉癌組織中NK

9、G2D配體MICA，ULBP1,2，3的mRNA和其蛋白表達(dá)，了解NK細(xì)胞用于喉癌生物治療的可行性。其次通過(guò)基因工程手段構(gòu)建NKG2D的真核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染YT細(xì)胞(NK細(xì)胞系)，篩選單克隆細(xì)胞，建立表達(dá)NKG2D的效應(yīng)細(xì)胞，將效應(yīng)細(xì)胞與喉癌細(xì)胞Hep2接觸后觀察轉(zhuǎn)染NKG2D前后NK細(xì)胞對(duì)喉癌細(xì)胞的殺傷功能變化，為NK細(xì)胞用于喉癌生物治療的可行性提供理論依據(jù)。 方法: (1)應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)人喉癌細(xì)胞Hep2及喉癌組織中

10、NKG2D配體MICA，ULBP1，2，3的mRNA表達(dá)。(2)NKG2D克隆載體的構(gòu)建。從NK細(xì)胞系NK-92細(xì)胞中經(jīng)RT-PCR技術(shù)獲得NKG2D cDNA，與pGEM-T Easy連接及轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，構(gòu)建NKG2D克隆載體，進(jìn)行DNA序列測(cè)定。(3)NKG2D真核表達(dá)載體的構(gòu)建。應(yīng)用限制性內(nèi)切酶將NKG2D基因從克隆載體上切下來(lái)，連接到熒光真核表達(dá)載體pEGFP-N1上，構(gòu)建pEGFP-N1/NKG2D真核表達(dá)載體。(4)真核表

11、達(dá)載體在CHO細(xì)胞中的表達(dá)及鑒定。將篩選出的pEGFP-N1/NKG2D質(zhì)粒通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中，經(jīng)G418篩選，克隆，RT-PCR鑒定NKG2D mRNA的表達(dá)，熒光顯微鏡、Western Blot和免疫組化方法鑒定NKG2D蛋白的表達(dá)。(5)真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染YT細(xì)胞及對(duì)YT細(xì)胞生物學(xué)功能影響。將pEGFP-N1/NKG2D質(zhì)粒通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到Y(jié)T細(xì)胞中，免疫組化方法檢測(cè)NKG2D蛋白在NKG2D轉(zhuǎn)染前后的變化；MTT方法檢測(cè)

12、YT細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后的增殖情況及對(duì)人喉癌細(xì)胞Hep2的殺傷情況；RT-PCR技術(shù)檢測(cè)殺傷相關(guān)分子，即抗病毒分子IFNγ、細(xì)胞增殖分子IL-2、溶膜分子perforin和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡分子家族TNF超家族(TNFα、Fas/FasL、TRAIL、TWEAK)的轉(zhuǎn)錄水平，并同時(shí)設(shè)置β-actin為RT-PCR系統(tǒng)的內(nèi)參照。 結(jié)果: (1)人喉癌細(xì)胞Hep2及喉癌組織中NKG2D配體MICA，ULBP1，2，3的-mRNA檢測(cè)。應(yīng)用

13、RT-PCR檢測(cè)Hep2細(xì)胞和21例新鮮喉癌組織中MICA，ULBP1,2，3的表達(dá)，同時(shí)以聲帶息肉組織作為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)Hep2細(xì)胞和喉癌組織中NKG2D配體MICA，ULBP3呈強(qiáng)勢(shì)表達(dá)，說(shuō)明喉癌易于引起NK系統(tǒng)免疫應(yīng)答，有NKG2D用于喉癌生物治療的研究?jī)r(jià)值和良好前景。 (2)NKG2D全長(zhǎng)cDNA的克隆。提取新鮮培養(yǎng)的NK-92細(xì)胞的總RNA，取5ug總RNA為模板，以oligo(dT)為引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。然后用NKG2D

14、的特異引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定和與pGEM-T Easy載體連接、酶切鑒定后測(cè)序，證實(shí)已獲得的cDNA為NKG2D的全長(zhǎng)cDNA，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致。 (3)pEGFP-N1/NKG2D重組表達(dá)載體的構(gòu)建。用EcoR I和BamH I從克隆載體pGEM-T Easy/NKG2D切下NKG2D片段，與經(jīng)相同雙酶切的pEGFP-N1質(zhì)粒進(jìn)行粘性末端連接。產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌HB101，利用PCR篩選陽(yáng)性克隆，提取純化PCR

15、陽(yáng)性重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，經(jīng)PCR和雙酶切鑒定陽(yáng)性的克隆即為構(gòu)建好的pEGFP-N1/NKG2D重組表達(dá)載體。 (4)NKG2D在CHO細(xì)胞中的表達(dá)。應(yīng)用脂質(zhì)體法將構(gòu)建好的pEGFP-N1/NKG2D重組表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，G418篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)后，挑選抗性克隆，RT-PCR鑒定mRNA的表達(dá)，熒光顯微鏡下觀察有綠色熒光發(fā)出、Western Blot和免疫組化方法鑒定蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示構(gòu)建的pEGFP-N1/NKG2

16、D質(zhì)粒能夠轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞并且有NKG2D的蛋白表達(dá)。 結(jié)論:(1)人喉癌細(xì)胞Hep2和喉癌組織中NKG2D配體MICA，ULBP3呈強(qiáng)勢(shì)表達(dá)，說(shuō)明喉癌易于引起NK系統(tǒng)免疫應(yīng)答，有NKG2D用于喉癌生物治療的研究?jī)r(jià)值和良好前景。(2)通過(guò)基因工程技術(shù)獲得了全長(zhǎng)的NKG2D基因片段，并且測(cè)序正確，成功構(gòu)建了pEGFP-N1/NKG2D真核表達(dá)載體。(3)經(jīng)轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞后，能夠在熒光顯微鏡下發(fā)出綠色熒光，RT-PCR檢測(cè)出mRNA的

17、表達(dá)，Western Blot和免疫組化方法鑒定蛋白的表達(dá)。(4)轉(zhuǎn)染YT細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前后增殖效應(yīng)沒(méi)有變化：NKG2D蛋白在NKG2D轉(zhuǎn)染后明顯增強(qiáng)；NKG2D轉(zhuǎn)染YT細(xì)胞后對(duì)Hep2細(xì)胞殺傷活性有明顯增強(qiáng)作用，殺傷相關(guān)分子IFNγ、IL-2、TNFα、Perforin、TWEAK有明顯增強(qiáng)。(5)NKG2D基因修飾YT細(xì)胞為使用NK細(xì)胞系進(jìn)行免疫治療奠定了理論和技術(shù)基礎(chǔ)。上述研究表明，喉癌是一種易于引起NK系統(tǒng)免疫應(yīng)答的腫瘤之一，是喉癌