一種新的人NK細(xì)胞系的特性及其抗腫瘤效應(yīng)研究.pdf

1、自然殺傷細(xì)胞(Natural killer cell，NK細(xì)胞)作為固有免疫系統(tǒng)的重要成員在機(jī)體抗腫瘤免疫中扮演重要的角色。使用NK細(xì)胞進(jìn)行抗腫瘤治療已引起人們高度的重視，目前已有研究進(jìn)入了臨床實(shí)驗(yàn)階段。基于NK細(xì)胞的腫瘤免疫治療包括內(nèi)源性NK細(xì)胞的誘導(dǎo)活化、同種反應(yīng)性NK細(xì)胞輸注、體外擴(kuò)增的自體或供者NK細(xì)胞及NK細(xì)胞系的過(guò)繼轉(zhuǎn)輸?shù)?。相比較而言，自體或同種異體NK細(xì)胞在進(jìn)行抗瘤治療時(shí)存在一定的局限性，而永生化的人NK細(xì)胞系因具有較強(qiáng)的

2、細(xì)胞毒作用、體外易擴(kuò)增培養(yǎng)、且不存在其他細(xì)胞污染等優(yōu)點(diǎn)，可以克服自體或異體NK細(xì)胞的局限性，具有很好的臨床應(yīng)用前景?，F(xiàn)有可用于腫瘤治療的NK細(xì)胞系(NK-92細(xì)胞)由西方國(guó)家建立，盡管HLA分子不匹配是NK細(xì)胞行駛功能的有益因素，但是由于不同種族間HLA分子的差異很可能在受者體內(nèi)產(chǎn)生抗HLA的抗體從而抑制免疫治療的效果，故西方國(guó)家建立的NK細(xì)胞系可能不適合用于中國(guó)腫瘤病人的治療。因此，建立國(guó)人的NK細(xì)胞系并將其用于腫瘤治療尤為重要。

3、r>　　 另外，腫瘤的診斷及分期對(duì)于臨床治療方案的制定至關(guān)重要。肺癌作為惡性腫瘤中最常見(jiàn)的死亡原因，嚴(yán)重威脅人類(lèi)的健康。肺癌的高轉(zhuǎn)移率和復(fù)發(fā)率嚴(yán)重阻礙肺癌患者生存期的提高，尋找用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞監(jiān)測(cè)的標(biāo)志物并建立合適的檢測(cè)方法成為亟需解決的問(wèn)題。
　　 本研究利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)本室己建立的人NK細(xì)胞系(NKG細(xì)胞)的表型、活化狀態(tài)及功能分子的表達(dá)進(jìn)行分析；利用3H摻入實(shí)驗(yàn)測(cè)定不同劑量輻照后NKG細(xì)胞的增殖情況；利用51Cr殺傷實(shí)驗(yàn)

4、測(cè)定NKG細(xì)胞的細(xì)胞毒活性；建立人卵巢癌裸鼠腹水瘤模型評(píng)價(jià)NKG細(xì)胞的體內(nèi)抗腫瘤活性；利用波浪式生物反應(yīng)器建立NKG細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的工藝流程，建立NKG細(xì)胞主細(xì)胞庫(kù)和工作細(xì)胞庫(kù)，并按《藥典》三部(2005年版)的相關(guān)要求進(jìn)行了細(xì)胞鑒別試驗(yàn)、無(wú)菌試驗(yàn)、外源性因子檢測(cè)、致瘤性檢查及急性毒性試驗(yàn)。另外，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)LunX等多利腫瘤標(biāo)志物mRNA的水平，分析LunX mRNA與肺癌病理分期及臨床治療效果之間的關(guān)系。利用上述

5、方法所取得的研究結(jié)果如下：
　　 1. NKG細(xì)胞表型及功能分子的表達(dá)
　　 NKG細(xì)胞是本研究室863課題組于2003年建立的永生化的人NK細(xì)胞株。NKG細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)，成團(tuán)細(xì)胞較多，倍增時(shí)間為2-3天。NKG細(xì)胞的表型鑒定為CD56+CD16-CD27-CD3-αβTCR-γδTCR-CD4-CD8-CD19-CD161-CD45+。NKG細(xì)胞表面表達(dá)高水平CD2、CD58、CD11a、CD54、CD11b及CD11c

6、等粘附分子；高表達(dá)共刺激分子CD48。NKG細(xì)胞表面表達(dá)抑制性受體CD94/NKG2A、CD158b和CD85j，同時(shí)亦表達(dá)高水平NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D和NKG2C等活化性受體。另外，與細(xì)胞殺傷功能相關(guān)的TRAIL、FasL、granzyme B、perforin和IFN-γ等均在NKG細(xì)胞中表達(dá)。上述結(jié)果表明，NKG細(xì)胞具有活化性NK細(xì)胞的特征。
　　 2.NKG細(xì)胞的抗腫瘤細(xì)胞毒活性及其分子機(jī)制

7、>　　 NKG細(xì)胞對(duì)多種腫瘤細(xì)胞系均有較強(qiáng)的殺傷活性，尤其是對(duì)SGC7901和Ho-8910細(xì)胞的殺傷活性＞80％(E/T=20/1)。NKG細(xì)胞對(duì)Ho-8910細(xì)胞的殺傷活性明顯高于NK-92、NKL及YT細(xì)胞。體外抗體阻斷及中和實(shí)驗(yàn)表明NKG細(xì)胞的細(xì)胞毒活性主要依賴(lài)于NKG2D和NKp30識(shí)別機(jī)制。當(dāng)γ輻照劑量達(dá)800cGy時(shí)，輻照后的NKG細(xì)胞失去增殖能力，但在48小時(shí)內(nèi)維持其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性。體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明800cGy

8、輻照后的NKG細(xì)胞對(duì)原代分離的人卵巢癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的殺傷活性(75％～45％，E/T=20/1)。
　　 3.人卵巢癌小鼠模型中NKG細(xì)胞的免疫治療作用
　　 利用Ho-8910細(xì)胞以腹腔注射的方式接種裸鼠，成功建立人卵巢癌裸鼠腹水瘤模型。當(dāng)將800cGy輻照后的NKG細(xì)胞與Ho-8910細(xì)胞按5∶1混合后接種裸鼠，結(jié)果顯示小鼠成瘤時(shí)間由28～44天延遲至90～135天，成瘤率由100％明顯降低至50％。NKG細(xì)胞治療組

9、小鼠腹圍明顯減少，盡管在觀(guān)察時(shí)間內(nèi)50％小鼠死亡，但其平均生存時(shí)間由61.5天明顯延長(zhǎng)至210.2天。以上結(jié)果表明NKG細(xì)胞在小鼠體內(nèi)對(duì)人卵巢癌細(xì)胞具有明顯的殺傷功能。
　　 當(dāng)在Ho-8910細(xì)胞接種后第21天，給予800cGy輻照后的NKG細(xì)胞進(jìn)行治療，結(jié)果表明治療組小鼠成瘤時(shí)間由28～38天延后至56～66天，小鼠成瘤率由100％降低至62.5％，成瘤鼠病情進(jìn)展較緩慢，平均生存時(shí)間由64.6天延長(zhǎng)至119.6天。當(dāng)在Ho-

10、8910細(xì)胞接種后第35天選擇已成瘤小鼠，給予800cGy輻照后的NKG細(xì)胞進(jìn)行治療，結(jié)果表明治療后小鼠腹圍變化較對(duì)照組明顯減慢，盡管最終治療組小鼠亦全部死亡，但其平均生存時(shí)間由64.2天明顯延長(zhǎng)至93.6天。上述動(dòng)物模型的結(jié)果表明，輻照后NKG細(xì)胞具有明顯的治療卵巢癌的作用。
　　 4.NKG細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)工藝的建立
　　 利用波浪式生物反應(yīng)器建立NKG細(xì)胞大規(guī)模連續(xù)培養(yǎng)的工藝流程，具體流程如下：接種密度：2.0×10

11、4cells/ml；培養(yǎng)基：α-MEM完全培養(yǎng)基(α-MEM液體培養(yǎng)基含10％新生牛血清、10％馬血清)，添加終濃度為100U/ml的rhIL-2；接種體積：500ml，分別于接種后2、4、6天補(bǔ)加500ml完全培養(yǎng)基及rhIL-2溶液(終濃度為100U/ml)；最大培養(yǎng)體積：＜2000ml。培養(yǎng)條件：37℃，5.0％CO2，CO2流速為0.15L/min，7rpm/7°。按照該工藝流程培養(yǎng)得到的NKG細(xì)胞數(shù)量、純度及殺傷活性等均可滿(mǎn)足

12、臨床治療的要求。
　　 5.NKG細(xì)胞急性毒性檢測(cè)
　　 使用高于臨床使用劑量150倍的NKG細(xì)胞(1×108cells/鼠)，經(jīng)800cGy輻照后通過(guò)腹腔注射的方式輸入C57BL/6小鼠體內(nèi)，連續(xù)觀(guān)察7天，三批小鼠均為未發(fā)生毒性反應(yīng)、過(guò)敏反應(yīng)、局部刺激反應(yīng)；實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組小鼠體重增加平穩(wěn)，小鼠體重及體重增加量?jī)山M之間均無(wú)顯著性差異，說(shuō)明NKG細(xì)胞無(wú)急性毒性作用。
　　 6.NKG細(xì)胞種子庫(kù)的建立及檢定
　

13、　 利用本研究建立的NKG細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)工藝，建立主細(xì)胞庫(kù)及工作細(xì)胞庫(kù)。對(duì)工作細(xì)胞庫(kù)的檢定結(jié)果表明，NKG細(xì)胞的表型與原始庫(kù)一致，無(wú)細(xì)菌、真菌及支原體污染，外源性病毒因子檢測(cè)為陰性，體內(nèi)外均無(wú)致瘤性。
　　 7.LunX mRNA在非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移早期診斷及療效評(píng)價(jià)中的作用
　　 利用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)肺癌患者、健康人、肺炎患者及其他腫瘤患者(包括乳腺癌和食道癌)的外周血或胸水樣品中LunX、CEA、CK

14、19、VEGF-c、hRNPA2/B1等腫瘤標(biāo)志物mRNA的水平，結(jié)果表明LunX mRNA僅在非小細(xì)胞肺癌患者的外周血(75.0％，33/44)及胸水(92.9％，13/14)中有表達(dá)，而在健康人、肺炎、其他上皮來(lái)源的腫瘤患者外周血及結(jié)核性胸膜炎胸水中均無(wú)表達(dá)，明顯優(yōu)于其他各種標(biāo)志物，而且外周血中LunX mRNA的水平及其陽(yáng)性率與肺癌的臨床分期成正相關(guān)。進(jìn)一步對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者治療前后外周血中上述基因mRNA的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)分析，

15、結(jié)果表明治療后患者外周血中LunX、CK19mRNA水平較治療前明顯降低，治療前后VEGF-C、CEA、hnRNP A2/B1 mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯差異。LunX與CK19 mRNA均可作為療效評(píng)價(jià)的指標(biāo)，但因CK19mRNA在其他腫瘤患者外周血中亦有表達(dá)，故LunX mRNA作為肺癌患者治療效果評(píng)價(jià)的指標(biāo)更為靈敏和特異。
　　 結(jié)論：
　　 NKG細(xì)胞具有活化的人NK細(xì)胞特征，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒作用。利用