人IFn-α基因修飾NK細胞系的建立以及人IFn-α-人Il-15基因修飾NK細胞抗腫瘤功能機制研究.pdf

1、研究目的：
　　 惡性腫瘤嚴重危害人類健康，其死亡人數(shù)約占世界總死亡人數(shù)的四分之一，且死亡率常年居高不下。目前用于惡性腫瘤治療的手段主要包括手術(shù)、化療、放療、內(nèi)分泌治療和射頻消融治療等，由于缺乏特異性和靶向性，在殺傷腫瘤細胞的同時，機體正常細胞的功能也遭到破壞，從而導(dǎo)致患者免疫功能受損，生存質(zhì)量下降。近來，隨著免疫學(xué)、分子生物學(xué)和細胞生物學(xué)的交融和發(fā)展，以機體免疫細胞為主體的細胞免疫治療，以其強大的抗腫瘤作用和較低的毒副作用，逐

2、步成為腫瘤治療研究的新方向。
　　 自然殺傷(Naturalkiller,NK)細胞作為機體天然免疫系統(tǒng)中不可或缺的組成部分，是機體抵抗腫瘤和病毒感染細胞的第一道天然防線，也是連接天然免疫和獲得性免疫之間的橋梁。基于NK細胞的抗腫瘤免疫治療以其獨特的抗腫瘤效果引起人們的高度重視，現(xiàn)已進入臨床試驗階段，主要包括自體NK細胞的活化，同種異體NK細胞的輸注，體外擴增NK細胞的輸注以及NK細胞系的過繼轉(zhuǎn)輸?shù)?。由于體外NK細胞的純化和大規(guī)

3、模培養(yǎng)仍具有較高的技術(shù)難度，NK細胞系以其易于體外擴增和大規(guī)模培養(yǎng)、具有較強的細胞毒作用等優(yōu)點，克服了自體以及同種異體NK細胞治療的局限性，具有廣闊的應(yīng)用前景。NK細胞系在體外生長狀態(tài)良好，能夠通過基因修飾等手段增強抗腫瘤活性。
　　 在眾多活化NK細胞的細胞因子中，IFN-α占有非常重要的地位。IFN-α屬于(Ⅰ)型干擾素家族，廣泛應(yīng)用于造血系統(tǒng)腫瘤和某些實體腫瘤的治療中，并且能夠通過下調(diào)癌基因的表達，誘導(dǎo)腫瘤抑制基因進而影響

4、腫瘤細胞的功能，還能夠促進免疫細胞，比如T細胞，DC，NK細胞的分化和活化，介導(dǎo)IFN誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫活性。IFN-α現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于DC的基因修飾，使其適應(yīng)腫瘤過繼免疫治療的要求。
　　 白細胞介素-15(IL-15)是由Grabstein等于1994年在猴腎表皮細胞系cv21/EBVA的培養(yǎng)上清中發(fā)現(xiàn)，早期被定義為T細胞生長因子，在自體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，調(diào)節(jié)天然免疫和獲得性免疫方面發(fā)揮多重作用。IL-15與IL-2在功能上有許多

5、相似之處，均可以誘導(dǎo)CD34+的細胞分化為NK細胞，但IL-15在NK細胞的分化和功能上發(fā)揮了更為重要的作用，實驗證實，在IL-15Rα-/-和IL-15-/-小鼠中，NK細胞無法正常發(fā)育、成熟并發(fā)揮功能。
　　 本研究選用了兩種對NK細胞發(fā)育、分化、功能等起關(guān)鍵作用的細胞因子IL-15和IFN-α，對NK細胞系NKL進行基因修飾。建立了hIFN-α基因修飾的NKL細胞，證實修飾后的細胞能夠有效抑制肝癌的生長，并探討了作用機制。

6、前期實驗中建立了hIL-15基因修飾的NKL細胞系，并證實了其在體外對肝癌細胞的殺傷效果，本研究進一步確證了hIL-15修飾后NKL細胞在體內(nèi)對肝癌的治療效果，并初步探討了其作用機制。同時研究了hIL-15基因修飾后的NKL細胞對白血病的抑制效果和作用機制。結(jié)果證實，修飾后的NKL細胞具有更為顯著地抗腫瘤作用，更加符合腫瘤過繼免疫治療的要求。
　　 研究方法：
　　 首先，我們建立了hIFN-α基因修飾的NKL細胞，并研

7、究其對肝癌的抑制作用和殺傷機制。通過PT-PCR方法從外周血PBMC中擴增hIFN-α1基因全長，插入pSecTagB真核表達載體中;通過電穿孔技術(shù)將hIFN-α基因轉(zhuǎn)染入NKL細胞中;通過RT-PCR方法檢測hIFN-α基因轉(zhuǎn)染后，NKL細胞IFN-α的mRNA水平，和肝癌細胞上凋亡相關(guān)分子Fas、Mcl-1、Bcl-xl的表達水平;通過RNAi技術(shù)，下調(diào)HepG2細胞上Fas的表達水平;通過Real-timePCR檢測NK細胞殺傷相

8、關(guān)分子的mRNA水平;通過流式細胞術(shù)，檢測NK細胞殺傷相關(guān)分子和HepG2細胞Fas的蛋白水平;通過MTT法檢測NK細胞對肝癌細胞系以及原代肝癌細胞的殺傷;通過抗體阻斷實驗，檢測IFN-γ和TNF-α在NKL-IFNα細胞對HepG2細胞殺傷過程中的作用;利用皮下注射和腹腔注射兩種不同荷瘤方式建立裸鼠荷瘤模型，通過檢測荷瘤小鼠瘤體積和小鼠生存期來驗證NKL-IFNα細胞的治療效果。
　　 其次，我們驗證了hIL-15基因修飾的N

9、KL細胞對肝癌的治療作用，并探討其作用機制。利用皮下注射和腹腔注射兩種不同荷瘤方式建立裸鼠荷瘤模型，通過檢測荷瘤小鼠脾重、肝重、瘤重、脾臟淋巴細胞數(shù)和小鼠生存期來驗證NKL-IL15細胞的治療效果;通過ELISA檢測NK細胞上清中IFN-γ和TNF-α的分泌水平;通過流式細胞術(shù)檢測NK細胞殺傷相關(guān)分子NKp80、顆粒酶B、Perforin、TRAIL和HepG2細胞上NKG2D配體的表達水平;通過細胞計數(shù)法檢測與NKL-IL15細胞共培

10、養(yǎng)后，HepG2細胞的增殖能力;通過MTT法檢測NK細胞對肝癌細胞的殺傷活性;通過抗體阻斷實驗，檢測NKG2D、IFN-γ和TNF-α在NKL-IL15細胞對HepG2細胞殺傷過程中的作用。
　　 最后，我們探討了hIL-15基因修飾的NKL細胞對白血病的治療作用。通過MTT法檢測NK細胞對白血病細胞系以及原代白血病細胞的殺傷活性;通過ELISA檢測NK細胞上清中IFN-γ和TNF-α的分泌水平;通過流式細胞術(shù)檢測NK細胞殺傷相

11、關(guān)分子NKp80、顆粒酶B、Perforin和K562細胞上NKG2D配體的表達水平;通過通過細胞計數(shù)法檢測與NKL-IL15細胞共培養(yǎng)后，K562細胞的增殖能力;通過抗體阻斷實驗，檢測NKG2D、IFN-γ和TNF-α在NKL-IL15細胞對K562細胞殺傷過程中的作用;利用皮下注射和腹腔注射兩種不同荷瘤方式建立NOD/SCID鼠荷瘤模型，通過檢測荷瘤小鼠瘤體積、瘤重和小鼠生存期來驗證NKL-IL15細胞的治療效果。
　　 結(jié)

12、果：
　　 結(jié)果一:hIFN-α基因修飾NKL細胞系的建立及其抗肝癌功能與機制研究
　　 1.構(gòu)建hIFN-α基因修飾的NKL細胞系我們已經(jīng)成功建立了hIFN-α基因修飾的NKL細胞系，NKL-IFNα細胞能夠分泌大量的IFN-α。
　　 2.IFN-α基因修飾能夠增強NKL細胞對HCC的殺傷活性NKL-IFNα細胞對肝癌細胞系HepG2、H7402細胞和原代肝癌細胞的殺傷活性顯著增強。特別是，IFN-α基因修飾

13、亦能增強NKL細胞對HBV+肝癌腫瘤細胞HepG2.2.15細胞的殺傷效果。
　　 3.IFN-α基因修飾增強NKL細胞的活性hIFN-α基因修飾能夠上調(diào)NKL細胞中殺傷相關(guān)分子TNF-α、IFN-γ、perforin、GranzymeB和FasL的表達，從而增強NKL細胞對HCC的細胞毒性。
　　 4.NKL-IFNα細胞誘導(dǎo)的Fas表達能夠增強對HCC的殺傷敏感性HCC表面Fas的表達在NKL-IFNα細胞介導(dǎo)的細胞

14、毒性反應(yīng)中起到主導(dǎo)作用。阻斷HepG2細胞表面Fas的表達，會使NKL-IFNα細胞所介導(dǎo)的殺傷效果顯著下降。
　　 5.NKL-IFNα細胞通過分泌TNF-α和IFN-γ誘導(dǎo)HCC細胞上Fas的表達阻斷TNF-α和IFN-γ能夠降低HepG2表面Fas的表達，進而抑制了NK細胞介導(dǎo)的細胞毒性作用。說明，NKL-IFNα細胞對HCC的殺傷是Fas依賴的，TNF-α和IFN-γ介導(dǎo)的。
　　 6.IFN-α基因修飾能夠增強

15、NKL細胞在小鼠體內(nèi)抑制肝癌的效果NKL-IFNα細胞能夠在腹腔荷瘤和皮下荷瘤小鼠模型中，抑制小鼠體內(nèi)肝癌細胞的生長，延長小鼠的生存期。
　　 結(jié)果二:hIL-15基因修飾的NKL細胞系在小鼠體內(nèi)抗HCC作用及機制研究
　　 1.在小鼠荷瘤模型中，IL-15基因修飾的NKL細胞具有顯著抗HCC作用(
　　 )NKL-IL15細胞治療能夠有效抑制腹腔和皮下荷瘤兩種荷瘤小鼠模型中肝癌細胞在荷瘤小鼠體內(nèi)的生長，延長小鼠

16、的生存期，發(fā)揮良好的治療效果。
　　 2.IL-15基因修飾能夠增強NKL細胞對HCC細胞的應(yīng)答IL-15基因修飾后的NKL細胞，對HepG2細胞的刺激更加敏感，能夠上調(diào)殺傷相關(guān)分子的表達，從而增強對HCC的殺傷效果。
　　 3.IL-15基因修飾的NKL細胞能夠抑制HCC細胞的增殖IL-15基因修飾的NKL細胞能夠通過分泌細胞因子，抑制HCC的增殖，增強抗腫瘤功效。
　　 4.IL-15基因修飾的NKL細胞通過

17、分泌TNF-α和IFN-γ上調(diào)HCC細胞上NKG2D配體的表達NKL-IL15細胞通過分泌TNF-α和IFN-γ上調(diào)HCC細胞上NKG2D配體的表達，進而增強HCC對NK細胞的殺傷敏感性。
　　 5.NKL-IL15細胞殺傷功能的增強依賴于NKG2D的識別和TNF-α的分泌NKG2D的識別和TNF-α的分泌，在NKL-IL15介導(dǎo)的HCC殺傷過程中起到非常重要的作用。
　　 結(jié)果三:hIL-15基因修飾NKL細胞的抗白血

18、病功能及機制研究
　　 1.hIL-15基因修飾能夠增強NKL細胞對白血病細胞的殺傷功能hIL-15基因修飾能夠增強NKL細胞對白血病細胞系和原代白血病細胞的殺傷功能。
　　 2.IL-15基因修飾的NKL細胞能夠抑制白血病細胞的增殖，誘導(dǎo)白血病細胞上NKG2D配體的表達IL-15基因修飾的NKL細胞能夠通過分泌細胞因子抑制白血病細胞的增殖，同時誘導(dǎo)白血病細胞表面NKG2D配體的表達，促進了NKL細胞對白血病細胞的殺傷。

19、
　　 3.IL-15基因修飾促進了NKL細胞的活化IL-15基因修飾能夠增強NKL細胞殺傷相關(guān)受體和分子的表達，進而增強NKL細胞對白血病細胞的殺傷功能。
　　 4.IL-15基因修飾NKL細胞殺傷功能的增強依賴于NKG2D和IFN-γNKG2D的識別和IFN-γ的分泌，在NKL-IL15介導(dǎo)的白血病細胞殺傷過程中起到非常重要的作用。
　　 5.IL-15基因修飾能夠增強NKL細胞在小鼠體內(nèi)的抗腫瘤效果NKL-

20、IL15細胞能夠抑制小鼠體內(nèi)白血病細胞的生長，延長小鼠的生存期。
　　 6.NKL-IL15細胞能夠活化hPBMC，增強其對白血病細胞的殺傷NKL-IL15細胞具有對hPBMC的活化作用。
　　 結(jié)論：
　　 1.構(gòu)建hIFN-α基因修飾NKL細胞，在體內(nèi)和體外實驗中均證實其對肝癌的抑制作用，且NKL-IFNα細胞通過分泌TNF-α和IFN-γ誘導(dǎo)HCC細胞上Fas的表達，依賴Fas/FasL途徑發(fā)揮細胞毒作用。

21、
　　 2.驗證前期構(gòu)建的hIL-15基因修飾的NKL細胞，在小鼠體內(nèi)對肝癌的抑制作用，其殺傷作用依賴于NKG2D的識別和TNF-α的分泌。
　　 3.探討hIL-15基因修飾的NKL細胞對白血病的治療作用，初步研究其殺傷機制是依賴于NKG2D和IFN-γ。
　　 基因修飾的NK細胞系，可以通過細胞因子IL-15和IFN-α的修飾，增強細胞毒作用，使其適用于腫瘤的過繼免疫治療。基因修飾NK細胞系的應(yīng)用，能夠為疾病