sTGF-βRⅡ與IFN-γ基因聯(lián)合修飾肝細(xì)胞對移植性肝腫瘤治療的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本研究為探討sTGFβRsTGFβRⅡ和IFN-γ在抗肝腫瘤中潛在的協(xié)同作用，將構(gòu)建能穩(wěn)定聯(lián)合表達(dá)sTGFβRⅡ和IFN-γ的小鼠肝細(xì)胞株BNL-sTR/IFN-γ。以經(jīng)脾移植的方式將細(xì)胞導(dǎo)入移植性腫瘤模型小鼠體內(nèi)。通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明sTGFβRⅡ和IFN-γ聯(lián)合表達(dá)在抗腫瘤中有協(xié)同效應(yīng)，為惡性腫瘤的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究工作分為兩部分： 第一部分：穩(wěn)定表達(dá)sTGFβRⅡ和IFN-γ的BNL-sTR/IFN-γ細(xì)胞株的構(gòu)建。

2、 從小鼠肝臟提取mRNA，采用相應(yīng)引物RT-PCR擴(kuò)增得到sTGFβRⅡ基因片段。將該片段定向克隆至pcDNA3.1載體質(zhì)粒，經(jīng)amp抗性篩選、酶切鑒定、測序鑒定后，得到pcDNA3.1-sTGFβRⅡ真核表達(dá)質(zhì)粒，以脂質(zhì)體包裹轉(zhuǎn)染BNL細(xì)胞，經(jīng)G418抗性篩選得到穩(wěn)定表達(dá)sTGFβRⅡ的細(xì)胞株BNL-sTR。采用WesternBlotting方法檢測轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞裂解上清，證實(shí)其中含有可與sTGFβRⅡ抗體發(fā)生特異性反應(yīng)的目的蛋白

3、，分子量約為20kDa。 繼而用IFN-γ/Ad腺病毒感染BNL-sTR細(xì)胞，采用ELISA方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清，證實(shí)其中含有可與IFN-γ抗體發(fā)生特異性結(jié)合的目的蛋白。 研究結(jié)論： 1.成功構(gòu)建pcDNA3.1-sTGFβRⅡ真核表達(dá)質(zhì)粒； 2.獲得穩(wěn)定表達(dá)sTGFβRⅡ的BNL-sTR細(xì)胞株； 3.通過轉(zhuǎn)染IFN-γ/Ad腺病毒，獲得能聯(lián)合表達(dá)sTGFβRⅡ和IFN-γ的BNL-sTR/IFN

4、-γ細(xì)胞株。 第二部分：BNL-sTR/IFN-γ細(xì)胞治療移植性肝腫瘤的研究。 為了研究sTGFβRⅡ和IFN-γ體內(nèi)抗肝腫瘤的協(xié)同作用，采用經(jīng)脾移植的方法將BNL-sTR/IFN-γ細(xì)胞導(dǎo)入移植性肝腫瘤模型。 首先通過經(jīng)脾移植CT26細(xì)胞建立了小鼠移植性肝腫瘤模型，該方法誘導(dǎo)移植性肝腫瘤的成功率較高。預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)，脾臟移植105的CT26細(xì)胞，2周后解剖動(dòng)物，在肝臟可見米粒大小腫瘤組織，4至5周時(shí)，動(dòng)物死亡。

5、 在動(dòng)物模型建立以后，將其隨機(jī)分組后分別脾內(nèi)給予2×106細(xì)胞每只小鼠的BNL-sTR/IFN-γ細(xì)胞、BNL-sTR細(xì)胞和BNL-IFN-γ細(xì)胞作基因治療，并以未處理的肝腫瘤組和正常組小鼠為對照，以期通過在體內(nèi)高效表達(dá)相應(yīng)蛋白，達(dá)到抗肝腫瘤效果。 2周時(shí)BNL-sTR/IFN-γ細(xì)胞治療組和BNL-IFN-γ細(xì)胞治療組的血清mIFN-γ增加顯著，與其他三組比較，差異顯著(p＜0.01)。4周時(shí)BNL-sTR/IFN-γ細(xì)胞治

6、療組和BNL-IFN-γ細(xì)胞治療組的血清mIFN-γ與其他三組比較，差異顯著(p＜0.01)。但是相對于2周時(shí)的濃度，有所下降。2周時(shí)BNL-sTR/IFN-γ細(xì)胞治療組、BNL-sTR細(xì)胞治療組和BNL-IFN-γ細(xì)胞治療組的CTL活性與模型對照組和BNL細(xì)胞對照組相比較，有明顯的提高，差異顯著(p＜0.01)。BNL-sTR/IFN-γ細(xì)胞治療組和BNL-IFN-γ細(xì)胞治療組的CTL活性與BNL-sTR細(xì)胞治療組相比較，有明顯的提高

7、，差異顯著(p＜0.05)。BNL-sTR/IFN-γ細(xì)胞治療組、BNL-sTR細(xì)胞治療組和BNL-IFN-γ細(xì)胞治療組的NK活性與模型對照組和BNL細(xì)胞對照組相比較，有明顯的提高，差異顯著(p＜0.01)。BNL-sTR/IFN-γ細(xì)胞治療組和BNL-IFN-γ細(xì)胞治療組的NK活性與BNL-sTR細(xì)胞治療組相比較，有明顯的提高，差異顯著(p＜0.05)。2周時(shí)BNL-sTR/IFN-γ細(xì)胞治療組沒有形成可見的腫瘤結(jié)節(jié)，BNL-sTR細(xì)

8、胞治療組、BNL-IFN-γ細(xì)胞治療組、模型對照組和BNL細(xì)胞對照組都有可見的腫瘤結(jié)節(jié)形成，其中模型對照組的腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)量最多，體積也最大。BNL-sTR細(xì)胞治療組、BNL-IFN-γ細(xì)胞治療組的腫瘤結(jié)節(jié)相對數(shù)量較少，體積也較小。動(dòng)物經(jīng)脾移植基因修飾肝細(xì)胞后，存活期明顯延長。治療組與模型對照組比較，差異均有顯著性(p＜0.01)。同時(shí)期存活率比較，以BNL-sTR/IFN-γ細(xì)胞治療組為最高。 綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示，sTGFβR

9、Ⅱ和IFN-γ聯(lián)合表達(dá)有明顯的抗小鼠移植性肝腫瘤作用，且較單獨(dú)表達(dá)sTGFβRⅡ或IFN-γ有更顯著的作用。證明sTGFβRⅡ和IFN-γ聯(lián)合表達(dá)在抗小鼠移植性肝腫瘤中具有協(xié)同作用，經(jīng)脾移植基因修飾的肝細(xì)胞是靶向性治療肝腫瘤的有效方法。 研究結(jié)論： 1.構(gòu)建小鼠移植性肝腫瘤模型。 2.采用sTGFβRⅡ和IFN-γ基因修飾的肝細(xì)胞BNL，經(jīng)脾臟移植，能減弱腫瘤的生長和侵襲，延長模型小鼠生存期。提示sTGFβRⅡ和