靶向基因修飾樹突狀細胞瘤苗治療移植性肝癌的實驗研究.pdf

1、本文主要從以下幾部分展開： 第一部分： 目的: 克隆小鼠甲胎蛋白(murine alpha fetoprotein，mAFP)基因，構(gòu)建表達mAFP基因的重組腺病毒載體pAdBM5-mAFP，并進行鑒定。方法:體外培養(yǎng)分泌AFP的小鼠肝癌細胞Hepal-6，細胞經(jīng)Trizol裂解后提取總RNA， 設計特異性引物： 上游引物為 5′-AAGATCTCTGCGGTGAAGGAACAAG-3′， 下游引物為5′-GGTT

2、TAAACGCCCAAAGCATC-3′，通過RT-PCR克隆mAFP基因，測序確認后，插入到pAdBM5-GFP穿梭載體中，雙酶切鑒定重組腺病毒載體并保存。結(jié)論 :本研究克隆了小鼠mAFP基因，并成功構(gòu)建出表達mAFP基因的重組腺病毒載體pAdBM5-mAFP，為下一步開展肝癌的免疫基因治療奠定了基礎。目的: 構(gòu)建小鼠甲胎蛋白(mAFP)基因轉(zhuǎn)染的樹突狀細胞瘤苗(pAdBM5-mAFP-DC)。方法應用HEK293A細胞作為包裝細胞

3、，大量擴增含目的基因mAFP的重組腺病毒pAdBM5-mAFP；利用改良的CsCl超速離心法對其進行純化；用TCID50法測定重組腺病毒滴度。從C57BL/6J小鼠骨髓分離單個核細胞，用重組小鼠白細胞介素4(rmIL-4)和重組小鼠粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(rmGM-CSF)誘導和擴增DC。將重組腺病毒顆粒轉(zhuǎn)染DC，用流式細胞術(FACS)檢測轉(zhuǎn)染前后DC細胞表面分子MHCⅠ、MHCⅡ、CD18a(LEA)、CD54(ICAM)、C

4、D80(B7.1)、和CD86(B7.2)等的變化。結(jié)論:重組腺病毒pAdBM5-mAFP在HEK293A細胞中可成功擴增，所得病毒液量可滿足體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染實驗的需要。所擴增的重組腺病毒pAdBM5-mAFP可成功轉(zhuǎn)染DC而構(gòu)建出pAdBM5-mAFP-DC轉(zhuǎn)基因瘤苗；mAFP基因修飾后的DC能表達高水平的MHCⅠ、MHCⅡ、CD18a、CD54、CD80和CD86分子。 第二部分： 目的: 探討pAdBM5-mAFP-D

5、C瘤苗對C57BL/6J小鼠移植性肝癌發(fā)生發(fā)展的阻斷作用。方法:40只C57BL/6J小鼠隨機分為A、B、C、D和E組，每組8只。以免疫表達mAFP基因的重組腺病毒轉(zhuǎn)染DC(pAdBM5-mAFP-DC)為A組；免疫表達mAFP基因的質(zhì)粒DNA(pAdBM5-mAFP)為B組，免疫表達mAFP基因的另一種質(zhì)粒DNA(pcDNA3.1(+)-mAFP)為C組；免疫單純DC為D組，以注射單純PBS為對照組E組。免疫方法：A組和D組在每只小鼠

6、的右腋下注射5×105個細胞(0.1ml/次)，B組和C組在每只小鼠的右腋下注射10.0 μg重組質(zhì)粒(0.1ml/次)，E組，僅注射0.1ml PBS．每1周注射1次，連續(xù)免疫4次。在初次免疫后的第3周給所有小鼠移植Hepal-6肝癌細胞。觀察小鼠移植瘤的生長情況，于移植腫瘤第14天取血，用EIASA法檢測血清FNF-α和IFN-γ的水平，并處死小鼠，檢查成瘤情況。同時對腫瘤組織進行組織病理學檢查。結(jié)論 : 將構(gòu)建的pAdBM5-mA